基因重组沙蚕纤溶活性蛋白的克隆、表达和活性检测

目的 从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白.方法 提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA.根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序.根据该序列利用5‘RACE技术进行扩增,将获得的基因片段克隆到pMAL-p2载体中,在大肠杆菌BL21中进行融合表达.表达的融合蛋白经过直链淀粉树脂亲和色谱和DEAE-Sepharose 4B纯化后,纤维蛋白平板法检测其溶栓活性.结果 cDNA经5‘RACE扩增获得长度为260 bp的基因片段,推测其包含可编码83个氨基酸的完整序列(约9.0×103);重组pMAL-p2表达出51.0×103的融合蛋白,经过测定具有明显的溶栓活性.结论 从双齿围沙蚕中克隆获得的基因片段表达的融合蛋白具有溶栓活性,有望成为一种新型的纤溶药物.     

杀虫双在动物体内的代谢研究 三、杀虫双的高效薄层色谱法测定及其在大鼠体内的毒物代谢动力学研究

本文建立了高效薄层色谱测定大鼠血浆中杀虫双和沙蚕毒素的方法。以甲醇处理血浆样品,取上清液于高效硅胶板上点样,用甲醇-乙酸乙酯(5:4)展开,喷以钙黄绿素-氯化钯溶液,以薄层色谱扫描仪定量测定斑点荧光强度。血浆中加入杀虫双和沙蚕毒素,回收率分别为97.3±2.6％(n=5,CV=2.65％)和94.9±3.9％(n=5,CV=3.92％),检测限杀虫双为11.9ng,沙蚕毒素为5ng。大鼠静脉注射杀虫双后,血浆中立即检出沙蚕毒素。根据开放型二室模型数学公式计算杀虫双及沙蚕毒素代谢动力学各参数值。经口灌胃后,各时相血浆样品中均未检出杀虫双原形。除个别一小时血浆样品中检出低浓度沙蚕毒素外,其他样品中也未检出沙蚕毒素。     

大鼠杀虫双染毒后全血胆碱酯酶活力的变化

目的 探讨沙蚕毒系农药杀虫双对胆碱酯酶（ChE）活力是否有抑制及抑制的程度。方法 Wistar大鼠分为4组，分别以杀虫双或甲胺磷按1／16、1／8、1／4、1／2LD50剂量经口染毒，于染毒前及染毒后1／2、1、2、4、24h取大鼠尾尖血，以改良Ellman法测定ChE活力。结果 杀虫双1／16LD50剂量组染毒大鼠血ChE活力未受影响；随染毒剂量的加大，ChE活力逐步下降，1／2LD50剂量组大鼠血ChE活力抑制率为正常组的35.9%，差异有显著性（P＜0.01)。甲胺磷1／16LD60染毒剂量组大鼠血ChE活力抑制率为正常对照组的42.4%；随染毒剂量的加大，大鼠血ChE的活力进一步下降，1／2LD50剂量组大鼠血ChE活力抑制率达正常对照组的52.9%。各剂量杀虫双染毒组的ChE活力均高于对应的甲胺磷染毒组，差异有显著性（P＜0.01)。结论 大鼠经口杀虫双染毒后，在较高染毒剂量下可以抑制ChE活力，但抑制程度明显弱于甲胺磷。     

二巯丙磺钠对沙蚕毒系、氯苯甲脒、杀菌剂402和毒鼠强农药的特殊解毒作用

继二战英国发现二巯丙醇能抗含砷路易士毒气的特殊防治作用后,20世纪50年代前苏联科学家化学合成了具有易溶于水、有络合类金属和重金属离子特性的二巯丙磺钠,已广泛应用于多种类金属和重金属中毒的治疗[1].     

高效液相凝胶过滤色谱法测定沙蚕金属蛋白酶的纯度

目的采用高效液相色凝胶过滤谱法测定纯化的沙蚕金属蛋白酶的纯度。方法以TSK-GEL G2000SW（7.5×300mm）为色谱柱,20mM PB＋0.15MNaCl（pH7.0）为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为280nm,上样量为20μl,采用等度洗脱的方式,根据峰面积归一法,测定沙蚕蛋白酶的纯度。结果用该种方法检测的沙蚕蛋白酶的纯度高于95%。结论前期纯化的沙蚕金属蛋白酶获得了较为理想的纯度。     

杀虫双中毒死者血液、胃及肝中原型物及其代谢物分析

采用高效薄层色谱法（ＨＰＴＬＣ）、ＯＶ－１７填充柱和ＯＶ－１０１毛细管柱火焰光度检测器－气相色谱法（ＦＰＤ－ＧＣ）以及气相色谱－质谱法（ＧＣ－ＭＳ）对３例杀虫双中毒死者的血、胃及肝样品进行分析。在血、胃及肝样品中未检出杀虫双，均检出沙蚕毒素。在血样品中还检出了比沙蚕毒素更大的色谱峰，在胃样品中也检出了此色谱峰，但峰面积较小，肝样品未见此相应的色谱峰。经实验推断此化合物为杀虫双的另一代谢产物二甲基沙蚕毒素。     

杀虫双在动物体内的代谢研究 五、杀虫双代谢产物的分离与鉴定

经口灌胃给大鼠杀虫双77mg/kg和沙蚕毒素52mg/kg，分别收集6小时尿，采用层色谱（TLC）和气相色谱－质谱（GC－MS）分离和鉴定尿中主要代谢产物，给予杀虫双的鼠尿，经高效薄层色谱（HPTLC）分析，未检出杀虫双原形物，酶解也未见明显变化，经口给大鼠杀虫双或沙蚕毒素，鼠尿经HPTLC及GC－MS分析结果一致，据此推断，杀虫双和沙蚕毒素在大鼠体内代谢途径相同，杀虫双进入体内迅速转化成沙蚕毒素，继而在硫原子上甲基化和氧化，并在二甲胺部分进行脱甲基和水解。     

杀虫双在动物体内的代谢研究 四、杀虫双的气相色谱法测定及其在兔体内的毒物代谢动力学研究

本文建立了血浆中杀虫双及沙蚕毒素的GC-FPD测定方法。检测限(沙蚕毒素)为0.5ng。血浆中加入杀虫双和沙蚕毒素,回收率均在90%以上。兔静脉注射杀虫双30秒后,血浆中即可检出沙蚕毒素。杀虫双和沙蚕毒素在兔体内代谢动力学按二室拟合,求出各参数值。经口灌胃试验,血浆中未检出杀虫双和沙蚕毒素。     

日本刺沙蚕纤溶酶的酶学性质及其分类

［摘 要］ 目的：探讨日本刺沙蚕纤溶酶（NJF）的最适反应温度和最适反应pH 值以及金属阳离子和蛋白酶抑制剂对酶活性的影响,确定NJF的酶学分类。方法：采用偶氮酪蛋白(azocasein)水解法测定NJF的最适温度及最适pH 值;利用10种金属阳离子（Na⁺ 、K⁺ 、Cu ²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Al³⁺和Hg^2+）确定金属离子对NJF酶活性的影响;采用9种蛋白酶抑制剂（PMSF、EDTA、EGTA、β-巯基乙醇、苯甲脒、碘乙酸、抑肽酶、胃酶抑素A和大豆胰蛋白酶抑制剂）确定NJF的蛋白酶分类。结果：NJF具有较宽的热稳定性及pH稳定性范围,在40～80℃及pH7～11范围内有较好的稳定性,NJF酶最适温度为60℃, 最适pH值为9;Hg²⁺能够强烈地抑制NJF的酶活性,Cu²⁺具有较弱的抑制作用,而其他金属阳离子对酶活性无明显抑制作用;NJF的酶活性能被典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF完全抑制。结论：NJF是一种典型的丝氨酸蛋白酶。