Ⅰ型胶原膜、胞外基质提取物膜体外构建人工真皮能力比较

比较Ⅰ型胶原与胞外基质(extracellularmatrix,EM)提取物冻干后形成的膜(EM膜)在体外构建人工真皮的能力,以选择一种更有利于人工真皮形成的支架材料。方法分别使用小牛真皮部分提取的Ⅰ型胶原蛋白和胞外基质提取物冻干后制备基质网架,植入皮肤成纤维细胞,形成人工真皮。用扫描电镜观察I型胶原膜和EM膜的表面形态结构;选取不同的时间点,对种植于两种支架材料上的细胞进行计数,并利用间接ELISA方法检测人工真皮复合物中的细胞Ⅰ型胶原分泌情况,通过统计学的分析手段,对细胞的生长情况做出判断;用组织学方法观察人工真皮的形成情况。结果扫描电镜观察结果,两种膜在外观形态上无明显差异;细胞在EM膜上的增殖速度较Ⅰ型胶原膜快;ELISA分析显示,EM-细胞复合物中的成纤维细胞能够分泌更多的Ⅰ型胶原;与Ⅰ型胶原膜相比,EM在培养液中的降解更为缓慢,种植后的成纤维细胞在EM膜上生长旺盛,细胞层次明显多于前者,形成了较为明显的真皮样组织。结论EM膜适于成纤维细胞的生长,体外降解速率慢,是一种较Ⅰ型胶原膜更为理想的真皮支架材料。     

工程化肌腱修复肌腱缺损后力学特性的组织学基础

探讨组织工程化肌腱修复肌腱缺损后体内愈合过程中力学特性的组织学基础。取罗曼鸡肌腱细胞 ,经体外培养、扩增 ,与可降解生物材料聚羟基乙酸筛网构建工程化肌腱 ;将其植入修复 2 0只罗曼鸡第二趾深屈肌腱0 .5～ 0 .8cm缺损。术后第 2、4、6、8周取材 ,对标本进行大体、组织学及生物力学测定。植入 2、4、6、8周 ,新生肌腱在大体形态、细胞及胶原纤维排列方式上与正常肌腱相似 ,但新生肌腱的胶原纤维束并未形成较多的沿肌腱长度方向的致密结构 (“塑形”) ,导致其最大张力增加缓慢 ,到 8周时为 15 .4 0± 10 .6 3N,仅达正常肌腱的 2 3 ;8周时最大张应变为 2 2 .4 9± 10 .2 1 ,比正常肌腱大 10。结果表明 ,单纯聚羟基乙酸作支架 ,材料降解过快 ,新生肌腱失去了正常的力学刺激 ,“塑形”能力差 ,其生物力学强度低。提示 ,保持新生肌腱形成过程中正常的力学刺激对新生肌腱的“塑形”可能是至关重要的。     

Flow Perfusion Culture of Marrow Stromal Cells Seeded on Porous Biphasic Calcium Phosphate Ceramics

Calcium phosphate ceramics have been widely used for filling bone defects to aid in the regeneration of new bone tissue. Addition of osteogenic cells to porous ceramic scaffolds may accelerate the bone repair process. This study demonstrates the feasibility of culturing marrow stromal cells (MSCs) on porous biphasic calcium phosphate ceramic scaffolds in a flow perfusion bioreactor. The flow of medium through the scaffold porosity benefits cell differentiation by enhancing nutrient transport to the scaffold interior and by providing mechanical stimulation to cells in the form of fluid shear. Primary rat MSCs were seeded onto porous ceramic (60% hydroxyapatite, 40% β-tricalcium phosphate) scaffolds, cultured for up to 16 days in static or flow perfusion conditions, and assessed for osteoblastic differentiation. Cells were distributed throughout the entire scaffold by 16 days of flow perfusion culture whereas they were located only along the scaffold perimeter in static culture. At all culture times, flow perfused constructs demonstrated greater osteoblastic differentiation than statically cultured constructs as evidenced by alkaline phosphatase activity, osteopontin secretion into the culture medium, and histological evaluation. These results demonstrate the feasibility and benefit of culturing cell/ceramic constructs in a flow perfusion bioreactor for bone tissue engineering applications.     

骨髓间质干细胞体外分化为成骨细胞的实验研究

建立猪骨髓间质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离培养方法。对猪MSCs体外分化为成骨细胞的能力进行研究。抽取猪骨髓 ,体外培养MSCs。取第二代MSCs ,以含有不同浓度的抗坏血酸、β -磷酸甘油、地塞米松及碱性成纤维细胞生长因子等条件培养基进行成骨细胞诱导分化。通过细胞形态变化 ,碱性磷酸酶染色及钙盐沉积对成骨细胞进行鉴定。结果表明MSC细胞形态由长梭形向多边形转变 ,ALP染色阳性 ,VonKossa染色阳性 ,经体外诱导分化后呈典型的成骨细胞样改变。猪骨髓MSCs可在体外长期、稳定培养 ,具有向成骨细胞分化的潜能 ,可以为骨组织工程研究提供较理想的细胞来源和动物模型。     

正常人表皮细胞老化过程中生物学特性研究

目的　研究表皮细胞体外增殖与老化规律 ,为选择合适的组织工程化皮肤种子细胞提供依据。方法　取正常年轻人表皮细胞进行传代培养 ,以不同代龄细胞为实验对象 ,采用形态学观察、群体倍增时间(PDT)、免疫细胞化学及 β 半乳糖苷酶染色等一系列方法 ,检测表皮细胞老化规律。 结果　体外单层培养 9代 ,P2 (第 2代 )的PDT最短 ,前 5代增殖能力较强 ,P5(第 5代 )以后PDT明显延长 ,P8细胞不再增殖 ;随着细胞的连续传代培养 ,SA β Gal表达呈现从弱 (在年轻细胞中占 9% )到强 (在老化细胞中占 6 5 % )的趋势。 结论　体外培养第 1～第 5代表皮细胞可作为构建组织工程化皮肤的种子细胞。     

嗅鞘细胞/细胞外基质夹层支架的制备和形态学观察

目的研究嗅粘膜嗅鞘细胞在细胞外基质夹层支架内的生长特性,为治疗神经系统损伤寻找新的移植供体。方法嗅鞘细胞/细胞外基质夹层支架由四层毯状细胞外基质支架和三层嗅粘膜嗅鞘细胞相间叠加构成。纤维蛋白原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白按一定比例混合后,在新鲜大鼠血浆促凝作用下,构建单层毯状细胞外基质支架,在支架表面种植嗅粘膜来源的嗅鞘细胞。于倒置显微镜下观察嗅鞘细胞在支架上/内的生长过程,培养3d后,在细胞表面再次滴加上述细胞外基质混合胶以构建第二层毯状支架,依次重复两次。夹层支架制成组织切片和超薄切片后,用光镜和电镜观察和分析夹层支架的内部结构以及嗅鞘细胞在支架内的生长情况。结果由顶层至底层,支架内的嗅鞘细胞数量逐渐增多,细胞突起逐渐延长,细胞内分泌颗粒逐渐增多及其电子密度逐渐增高;细胞可在支架之间迁移,其水平排列方向具有一致性;嗅鞘细胞的细胞膜可与支架紧密粘附,支架内局部区域出现组织间隙。结论嗅粘膜嗅鞘细胞可在细胞外基质夹层支架内正常增殖和分化,细胞与支架具有良好的组织相容性。该夹层支架可作为嗅鞘细胞三维生长的载体,用于移植治疗神经损伤。     

A probabilistic approach to measure the strength of bone cell adhesion to chemically modified surfaces

Patterned surfaces with alternating regions of amino silanes [N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyl-trimethoxysilane (EDS)] and alkyl silanes [dimethyldichlorosilane (DMS)] have been used to alter the kinetics of spatial distribution of cellsin vitro. In particular, we have previously observed the preferential spatial distribution of bone cells on the EDS regions of EDS/DMS patterned surfaces (10). In this study, we examined whether the mechanism of spatial distribution of cells on the EDS regions was adhesion mediated. Homogeneous layers of EDS and DMS were immobilized on quartz substrates and characterized by contact angle, X-ray photoelectron spectroscopy, and spectroscopic ellipsometry. The strength of bone cell attachment to the modified substrates was examined using a radial flow apparatus, within either 20 min or 2 hr of cell incubation in the presence of serum. A Weibull distribution was chosen to characterize the strength of cell-substratum adhesion. Within 20 min of cell exposure, the strength of adhesion was significantly larger on EDS and clean surfaces, compared with DMS surfaces (p<0.0001). Within 2 hr of cell incubation, there was no statistical difference between the strength of cell adhesion to EDS, DMS, and clean surfaces. The results of this study suggest that the surface chemistry mediates adhesion-based spatial cell arrangement through a layer of adsorbed serum proteins.     

软骨组织工程中力学因素的影响及应用

力学因素是软骨组织工程中的重要影响因素之一。近年来的研究表明，力学作用可以刺激细胞因子及激素的分泌，改变三维支架上培养的软骨细胞的新陈代谢，从而促进软骨组织的生长与重建。目前已经有诸多关于体外构建软骨组织的报道，但对于其中的力学因素的影响（包括力学因素对软骨细胞增殖的促进及力学刺激的传导机制等）还没有完全认识。就以上几方面做一综述，并简单介绍生物反应器在软骨组织工程中的应用。     

胶原基真皮再生支架的微结构控制

综述了影响胶原基真皮再生支架微结构的各种因素及其控制方法。胶原基真皮支架的生物活性和修复创面的能力受到诸如除胶原外的其它主要材料 (第二组分 )、支架的孔径和孔隙率、支架厚度、生物活性因子以及交联度等多方面因素的综合影响。从材料学、生物学和医学的角度综合地应用物理、化学和生物学的手段探索各种影响因素的控制方法是组织工程皮肤研究的重点。     

浓集自体骨髓基质干细胞组织工程复合物治疗早期股骨头坏死的实验疗效

目的研究浓集自体骨髓基质干细胞组织工程复合物治疗兔早期股骨头坏死的实验疗效，为临床应用提供依据。方法24只新西兰大白兔随机分为两组，建立右侧股骨头骨缺损模型，并用液氮从缺损内将股骨头冷冻坏死，A组为对照组，仅植入空白明胶海绵，B组为实验组，植入复合物。术后每组分别于2、4、6、8周各处死3只动物，做影像学及组织学检查。进行有关指标检测。结果①影像学结果：随着时间延长无论是X线、CT表现还是MRI表现，实验组钻孔区由低密度逐渐增高，8周时有骨小梁结构；对照组钻孔区无新骨形成表现。②组织学结果：A组2周标本缺损区内，充满坏死的组织碎片；4周标本，缺损区内为疏松的纤维肉芽组织；6周标本缺损区内为纤维组织；8周标本缺损区内仍为纤维组织，无新生骨组织。B组2周标本缺损区内，有大量的成骨细胞；4周标本，缺损区内有大量骨小梁及类骨质填充；6周标本缺损区内出现比较成熟的骨小梁；8周标本缺损区内骨小梁成熟，骨髓组织形成。结论浓集自体骨髓基质干细胞组织工程复合物对兔股骨头坏死有极好的修复作用。