恒河猴血清孕酮含量测定方法

目的 建立恒河猴血清中孕酮含量测定方法.方法 本文采用放射免疫测定技术.结果 孕酮的回收率为94%,批内CV为5.1%~8.3%,批间CV为4.5%~7.7%,灵敏度为5~10pg.说明该方法具有较高的灵敏度、特异性、准确性.分别测定了幼年组、成年组和老年组的雌性恒河猴的血清中的孕酮含量分别为:(0.20±0.04)ng/mL、 (6.26±0.17)ng/mL和(0.35±0.06)ng/mL;成年雌性恒河猴月经周期孕酮的变化范围为:滤泡期为(1.10±0.12)ng/mL,排卵期(2.36±0.18)ng/mL,黄体期(6.17±0.15)ng/mL,妊娠期随着妊娠月份的增加,孕酮浓度也增加,最高可达50ng/mL.结论经实验验证,该方法灵敏、可靠、适用,可作为恒河猴血清中孕酮含量测定的一种方法.     

Hoechst 33342标记恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化

 [目的]探讨皮肤干细胞诱导分化为结膜上皮细胞,为组织工程结膜探索一种新型的种子细胞,为严重眼表疾病的治疗奠定基础。[方法]在体外培养纯化鉴定恒河猴皮肤干细胞,并用Hoechst 33342标记,标记后的皮肤干细胞与结膜上皮细胞进行Transwell非接触共培养10d,然后对诱导后的细胞用细胞免疫化学以及流式细胞术检测结膜上皮细胞的特异性表面标志,包括角蛋白4和粘蛋白4,同时检测细胞的Hoechst 33342表达情况。[结果]纯化后的皮肤干细胞比例接近90%。Hoechst 33342标记后的皮肤干细胞胞核显示蓝色荧光。在与结膜上皮细胞共培养10d后,皮肤干细胞显示结膜上皮细胞的标志粘蛋白4和角蛋白4阳性,流式细胞术检测阳性细胞比例分别为49.9%和95.6%,同时细胞还显示胞核的Hoechst 33342表达。[结论]灵长类动物恒河猴的皮肤干细胞,在体外的适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。     

bFGF在成年猴脊髓表达的免疫组织化学研究

目的探讨多肽生长因子bFGF在成年猴脊髓的表达分布情况，为成年猴脊髓存在该生长因子的表达提供可靠的免疫组织化学证据．方法取云南成年健康雄性猕猴1r8脊髓节段制作20μm厚的连续冰冻切片。间隔取片后以抗bFGF抗体行免疫组化ABC染色．在Olympus光学显微镜下观察bFGF样免疫阳性反应物（bFGF—IR）在脊髓的分布．结果bFGF—IR在成年猴脊髓腹角神经元、背角神经元、背角Lissauer束和中央管（X板层）均有分布．结论成年猴脊髓存在多肽生长因子bFGF的表达，提示该多肽生长因子在成年猴脊髓的生理过程中发挥作用，而且这种作用具有复杂性和多面性．     

猴免疫缺陷病毒荧光定量聚合酶链反应检测标准品的体外合成

【目的】合成猴免疫缺陷病毒(SIV)荧光定量检测标准品,并总结出核糖核酸(RNA)标准品体外合成的基本原则。【方法】首先寻找到SIV保守序列,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,克隆于T载体,测序,然后在所测得的SIV序列中进一步寻找保守序列,设计带有T7启动子的引物,PCR扩增,将所获得的PCR产物凝胶回收纯化,用T7RNA聚合酶进行体外合成RNA,再用PCR和电泳检测验证。【结果】通过数次引物调整,最终成功合成了SIV荧光定量PCR标准品。【结论】SIV荧光定量标准品的成功合成必须遵守以下4条基本原则:①必须选择保守序列;②在选择保守序列之后还需要搜索是否含有较多潜在的终止密码或者起始密码,设计引物使这些中止或起始密码排除在PCR目标产物之外;③必须注意将启动子(如T7启动子)挂在适当的引物上,以保证所合成的RNA模板与所要定量检测的RNA模板一致,而不是互补;④合成好RNA后必须检测,以保证不含其他RNA或者未消化完毕的DNA。     

中国恒河猴CD8+T细胞缺失模型制备

目的：测试用抗-HuCD8^＋T细胞单克隆抗体方法去除中国恒河猴体内CD8^＋T细胞效果，为建立CD8^＋T细胞缺失恒河猴模型提供实验依据。方法：抗-HuCD8^＋T抗体cM-T807在0、3、7d注射2只中国恒河猴，不同的时间取外周血，腹股沟和腋下淋巴结。制备CD3／CD4／CD8标记的外周血和淋巴细胞悬液，流式法测定恒河猴外周血和淋巴结中CD8^＋T细胞的去除效果。结果：注射了cM-T807的中国恒河猴，24h后，外周血中的CD8^＋T细胞缺失99．9％，持续27d；168h后，淋巴结中CD8^＋T细胞缺失约90．0％，持续21d。结论：首次证实抗-HuCD8^＋T细胞抗体cM-T807能有效去除中国恒河猴体内CD8^＋T细胞，为建立CD8^＋T细胞缺失动物模型（CD8^＋T Cells del）奠定基础。     

人工合成胸腺素α1在猴体内静脉注射的药动学研究

目的：研究人工合成胸腺素α1（sTα1）在猴体内i.v.的血药浓度-时间曲线、药动学参数特点。方法：用竞争性ELISA法测定sTα1在猴体内i.v.后血清中的药物浓度,用DAS药动学统计软件进行血药浓度-时间曲线拟合及药动学参数计算。结果：猴i.v.sTα11.2mg/kg的药动学特征符合二室开放模型,呈一级动力学消除。结论：猴i.v.sTα1的药动学行为符合二室一级消除。     

含吐温80中药注射剂对不同动物的过敏反应

目的:观察吐温80及含吐温80的中药注射剂对不同动物的过敏反应,阐明不同动物出现毒性反应的原因.方法:在犬和猴两种不同种属的动物体内,分别静注或静滴0.35%吐温80溶液及含相同百分含量吐温80的中药注射剂,观察动物的血压、心率、心电图及过敏反应.结果:犬静滴吐温80溶液及含吐温80的中药注射剂5ml·kg-1(内含吐温80 17.5mg·kg-1)后,均出现血压下降、心率减慢及皮肤红斑、流涎呕吐、痉挛抽搐等过敏反应;而猴静注或静滴吐温80溶液及含有吐温80的中药注射剂10ml·kg-1(内含吐温80 35mg·kg-1),未出现过敏反应.结论:犬对吐温的过敏反应是动物的种属性特异反应.     

SHIV-KB9感染中国恒河猴的实验研究

目的研究SHIV-KB9感染中国恒河猴的可能性,确定其有效病毒浓度,明确实验猴感染SHIV-KB9后的病毒复制和免疫反应情况,建立SHIV/SAIDS模型,并确定、完善SHIV/SAIDS模型评价指标。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查。选出6只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,分别用10倍系列稀释的病毒液静脉感染实验猴,使用流式细胞术、血常规检测、病毒分离、DNA-PCR和RT-PCR等方法确定实验猴是否被感染,以及感染后恒河猴体内病毒复制和免疫细胞损伤情况,持续测定3个月。结果实验猴的血浆病毒载量、病毒分离结果、CD4+/CD8+比值和CD4+细胞数等证实,4.8×106copies/mL以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。结论SHIV-KB9成功感染中国恒河猴为进一步建立SHIV/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。     

经瞳孔温热疗法后视网膜和脉络膜的细胞凋亡研究

目的探讨经瞳孔温热疗法（TTT）对视网膜、脉络膜层细胞凋亡表达的影响。方法利用恒河猴做动物模型，于治疗后不同时间点摘除双眼。应用组织学及TUNNEL检测技术，研究TTT治疗与细胞凋亡的相互关系，及对视网膜、脉络膜的组织病理学影响。结果正常猴眼视网膜及脉络膜均未见细胞凋亡发生。TTT治疗后，可见光斑中央细胞坏死、周边细胞凋亡发生。1h至4周，均可见凋亡阳性细胞，4个月时，仍可见少量凋亡细胞存在。同时，TTT治疗可引起视网膜不同程度的组织病理学损害。结论TTT可引起视网膜组织病理学损害。局部温度的升高会诱导视网膜脉络膜细胞凋亡的产生，减少坏死和炎症的程度。     

自体白色血栓性猴局部脑缺血模型的建立

目的探讨自体白色血栓在局部脑缺血动物模型制作中的作用与意义。方法自体白色血栓经血管介入造影法准确导入至猴大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）M1分支。结果栓塞后：数字影像血管造影系统（DSA）照影提示大脑中动脉M1分枝血管显影不良；1h后CT灌注成像可见急性局部脑缺血病灶；72h后CT平扫可见低密度陈旧性局部脑缺血病灶。两例进行尸体解剖，大脑TTC染色呈阳性；存活动物均有不同程度的脑缺血症状与体征。结论用自体白色血栓可建立稳定的猴局部脑缺血模型，因该动物模型是目前最接近临床病例的模型，对脑卒中的发生发展机制的研究、诊断及治疗，特别是溶栓治疗有着切实的临床前期应用价值。