生长抑制因子1基因核定位序列-绿荧光蛋白融合表达载体的构建及表达

目的构建p33^ING1b核定位序列（nuclear locating sequence，NLS）-绿荧光蛋白融合表达载体，将其转染到人胚肺纤维母细胞系MRC-5，建立稳定表达该融合蛋白的细胞模型。方法应用逆转录PCR获得p33^ING1b的NLS序列，然后将NLS序列插入绿荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1的多克隆位点，构建pEGFP-C1-NLS-绿荧光蛋白融合表达载体，再用此载体转染MRC-5细胞系，观察活细胞绿荧光蛋白的亚细胞定位。结果成功构建了pEGFP-C1-NLS-绿荧光蛋白融合表达载体，由该载体表达的绿荧光蛋白-NLS肽段融合蛋白产生的绿色荧光信号全部定位于胞核部位，而空载体转染的细胞表达的绿色荧光蛋白，绿色荧光信号定位于细胞浆中。结论在活细胞内，生理情况下p33^ING1b完全定位于细胞核，并且在其亚细胞定位的转运过程中，NLS肽段起着决定性作用。     

应用痘苗病毒载体表达猴轮状病毒VP4抗原基因

把编码猴轮状病毒（Ｒｈｅｓｕｓｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＲＶ）Ｖｐ４抗原的第４基因片段插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｐ７．５启动子下游，构建成在痘苗病毒Ｐ７．５启动子调控下表达猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因的重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４。应用磷酸钙沉淀技术将ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４ＤＮＡ转入ＴＫ－１４３细胞，在ＢＵＤＲ和Ｘ－ｇａｌ存在下筛选蓝色蚀斑。经３代以上纯化和病毒增殖，获重组病毒Ｒ－ＶＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４。蚀斑滴定其满度达到１５×１０１１ＰＦＵ／Ｌ。经核酸杂交试验证明所获得的重组痘苗病毒带有猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因。用重组病毒感染ＴＫ－１４３细胞（或Ｖｅｒｏ细胞），在感染后４８ｈ，用酶免疫法（ＥＩＡ）检测受染细胞上清液和细胞裂解液中表达的猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因均呈阳性反应。本试验为本研究室轮状病毒基因工程疫苗的一部分，为深入了解轮状病毒基因结构及其功能在方法学上奠定了必要的基础。     

一种运动想象脑电分类算法的研究

为了解决脑机接口(BCI)中不同意识任务下脑电信号分类问题,针对运动想象脑电(EEG)的事件相关去同步/同步(ERD/ERS)现象,提出一种基于支持向量机(SVM)的实用分类算法。该算法首先对脑电信号进行滤波,获得对运动想象比较敏感的频段,对滤波后的脑电信号,通过去均值减小由于均值不同所造成的误差,然后,再提取基于ERD/ERS的脑电能量场强特征,对提取的特征,运用支持向量机(SVM)进行分类,得到了满意的效果。结果表明,此方法可为脑机接口技术的应用提供有效的手段。     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因乳腺定位表达载体的构建及表达

目的:将人α-防御素-1(α-HNP-1)基因与山羊β-乳球蛋白(Beta-Lac-toglobulin,BLG)基因5’调控区序列融合,构建α-HNP-1基因的乳腺定位表达载体并对其进行检测。方法:用PCR方法获得α-HNP-1基因片断并克隆于pMD18-T载体,经DNA测序证实α-HNP-1基因序列无误后,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1-HNP-1重组质粒。用PCR方法扩增出BLG基因5’区调控序列并克隆到pcD-NA3.1-HNP-1中,构建乳腺定位表达载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1,该载体经脂质体包裹后,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠乳腺中进行表达。结果:经酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1构建正确,经ELISA检测,大鼠乳汁中有α-HNP-1表达,其48h表达量为27.67ng/ml,72h表达量为49.00ng/ml。结论:成功构建了α-HNP-1基因乳腺定位表达载体并最终在乳腺获得一定量表达,说明乳腺导管注入法是一种较理想的评价乳腺特异表达载体的可行性方法。     

Site-specific homologous recombination mutagenesis in group B streptococci

We describe the use of suicide vectors to generate site-specific mutations in group B streptococcus. This is accomplished by cloning gene-specific sequences into a temperature sensitive plasmid and selecting for clones which have undergone homologous recombination. The recombinan clones can be easily isolated by selecting for clones which have retained the antibiotic resistance markers that are present on the vector or cloned into the gene-specific sequences. To confirm the fidelity of the recombination events, PCR analysis is performed on chromosomal DNA isolated from the recombinant clones. Using this strategy, we have generated site- specific insertions in several capsule genes and have found that these insertions occurred as expected and that the mutations result in loss of capsule expression. In this report, we specifically detail the construction of cpsB mutants by single and double cross-over recombination and demonstrate that the resulting strains are acapsular.     

人肝癌特异性EB病毒载体—p^EBAF介导hGM—CSF基因的转移及表达

目的：探索人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF)基因在肝癌细胞中特异性表达的新途径。方法：构建p^EBAF/hGM-CSF基因克隆,用脂质体转染法将它分别导入分泌甲胎蛋白（AFP）的肝癌细胞株HepG2和不分泌APF的细胞株SMMC7721,构建两围基因的细胞克隆HepG2/hGM-CSF,SMMC7721/hGM-CSF,用MTT比色法测定细胞上清中hGM-CSF活性。结果：HepG2/hGM-CSF细胞上清hGM-CSF活性平均为46．5ng/ml/10^6/24h,SMMC7721细胞上清中无明显hGM-CSF活性。结：载体p^EBAF介导的hGM-CSF基因能在分泌AFP的肝细胞中获得特异性表达。     

使用人粘附分子—2启动子的衰变加速因子重组基因表达载体的构建及意义

目的：构建含人粘附分子-2（ICAM-2）启动子的人衰变因子（DAF）重组基因的真核细胞表达载体,运用于转基因动物克服异种器官排斥的研究。方法：双酶切本室巳构建质粒pGEM-7Zf-DAF,得到含人ICAM-2启动子及DAFcDNA序列的插入片段（3.7Kb）;双酶切pcDNA3真核表达载体,得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段DNA作为载体序列（4.4Kb）;两段DNA进行连接反应后转化细菌;阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定。根据人的ICAM-2启动子、DAFcDNA序列,设计引物行PCR特异扩增检验。结果：特异性3组酶切重组表达载体,产生符合设计的相应条带;PCR扩增出特异的318bp及1.7Kb的DNA片段,符合设计要求。结论：含人ICAM-2启动子的DAF重组基因表达载体获得成功。     

复制缺陷型腺病毒AdE1CMV-NGF的制备

通过DNA重组技术 ,经亚克隆和克隆过程构建分泌表达型重组腺病毒穿梭质粒pAdE1CMV NGF ;制备完整高纯度辅助病毒 pJM1 7。将 pAdE1CMV NGF和 pJM1 7在 2 93细胞中同源重组 ,获得复制缺陷型腺病毒重组体AdE1CMV NGF。梯度系列稀释测得滴度为 4 .6× 1 0 10 PFU/mL。     

小鼠对HBV DNA疫苗的免疫应答及细胞因子的免疫佐剂效应

目的 :观察编码小鼠 IL- 2及 IL- 12的真核表达载体 ,对 HBV DNA疫苗诱导 Balb/ c小鼠 (H- 2 d )免疫应答的调节作用及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P 815 - HBV- S)成瘤性的影响。　方法 :肌内注射HBV DNA疫苗及细胞因子真核表达载体 ;背部皮下接种 P 815 - HBV - S细胞 ,观察成瘤情况 ;EL ISA法测定血清抗HBs;4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL 活性。　结果 :免疫 8周后 ,以 p CR3.1- S、p CR3.1- S+IL- 2及 p CR3.1-S+IL- 12免疫的小鼠血清 ,45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1、1.98± 0 .17及 1.6 7± 0 .15 ,均较 p CR3.1组显著提高(P<0 .0 5 )。CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %、(6 1.9± 7.1) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与 p CR3.1- S组比较差异均显著 (P<0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 ,CTL细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) %、(5 6 .2± 7.5 ) %和 (75 .6± 9.1) % ,抗 CD8+ 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) %、(13.6± 1.9) %和 (16 .9±2 .3) %。对照组成瘤率为 10 0 % ,p CR3.1- S组小鼠成瘤率为 12 .5 % ,p CR3.1- S+IL- 12真核表达载体组成瘤率为0 ,对照组平均存活期和 6周后存活率分别为 2 8.4天和 0天。后两组分别 >38.2天及 45