Neurturin基因转染c17.2神经干细胞移植保护帕金森病大鼠模型的实验研究

目的探讨neurturin（NTN）基因转染c17．2神经干细胞脑内移植后对帕金森病大鼠模型的保护作用。方法构建高表达NTN蛋白的NTN-c17．2细胞克隆。实验分成NTN（12只）、空质粒（Mock，9只）和PBS组（9只），分别在各组大鼠的纹状体区移植入NTN-c17．2、Mock-c17．2和PBS，16d后再注入6-羟多巴胺（6-OHDA）。通过免疫组化、原位杂交、旋转行为和神经递质变化观察c17．2神经干细胞的分化，NTN基因的表达和NTN蛋白的保护作用。结果NTN-c17．2细胞移植后，细胞分化但仍持续分泌NTN蛋白。NTN蛋白可逆向运输到黑质，保护酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元免受6-OHDA的损害。动物模型旋转行为动态观测显示NTN的保护作用至少持续了4个月，NTN组要明显好于Mock和PBS组。移植后10个月，NTN和Mock组动物移植侧与健侧纹状体的神经递质如多巴胺浓度比值分别为95％（P〈0．05）和93％（P〈0．05），PBS组为75％。结论用带有NTN基因的神经干细胞移植治疗帕金森病，显示出良好的保护效果。     

骨形态发生蛋白2基因转染的骨髓间充质干细胞修复羊胫骨干骨缺损

目的 评价腺病毒介导的人骨形卷发生蛋白2(Adv-hBMP-2）基因转染的羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)对长骨干骨缺损的修复效果．方法 22只羊，体重18．1～29．5kg．制造羊胫骨干骨缺损(2．1cm)．分为4组：Ⅰ组．Adv-hBMP-2转染BMSCs组(8只)；Ⅱ组．腺病毒介导的β半乳槠苷酶(Adv-βgal)转染BMSCs组(6只)；Ⅲ组，未转染BMSCs组(6只)；Ⅳ组，未治疗组（2只)。细胞自身分泌的细胞外基质作为细胞载体。分期行X线、计量组织学检查和生物力学测定。结果 X线检查示Ⅰ组的羊胫骨干骨缺损内有明显骨痂形成；24周，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的愈合率分别为6/7、1／5、2／5及0／1，X线疗效评分显示Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ组的评分比较．差异有显著性意义。组织学检查显示，与其它组相比．Ⅰ组的新生骨量最多，并有皮质骨形成。生物力学测试示Ⅰ组的力学强度最大。结论 Adv-hBMP-2基因转染的BMSCs在缺乏骨传导性支架的条件下可修复长骨干骨缺损。     

猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠神经前体细胞株的构建

目的建立猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)永生化大鼠神经前体细胞株,为细胞移植治疗和转基因治疗提供稳定的细胞来源。方法利用脂质体介导的基因转染技术将含有SV40Tag的质粒pCMVSV40T/PUR转染原代培养的新生大鼠神经前体细胞,经嘌呤霉素筛选,阳性克隆扩大培养并连续传代。应用巢蛋白抗体进行细胞鉴定,5%胎牛血清诱导细胞分化后,应用免疫细胞化学法检测其分化能力,观察细胞的形态及其生长状况,绘制细胞生长曲线。用RT-PCR、Southern印迹杂交和免疫细胞化学法检测SV40Tag在转染细胞中的表达。结果转染细胞经筛选培养后获得1 个阳性细胞克隆,免疫细胞化学结果显示细胞的巢蛋白和微管相关蛋白2染色为阳性,增殖能力较强。5%胎牛血清可诱导转染细胞分化为微管相关蛋白2阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。Southern印迹杂交结果显示转染细胞基因组中存在SV40Tag cDNA,并可检测到SV40Tag mRNA及其蛋白的表达。转染细胞经扩大培养,命名为永生化神经前体细胞。贴壁培养的神经前体细胞,群体倍增时间为(22.9±2.7)h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论成功地构建了SV40Tag永生化的大鼠神经前体细胞株。     

毛乳头细胞高效培养方法探索

显微解剖法分离毛乳头效率低，细胞生长差，采用胶原酶Ｄ消化法直接将毛囊下部的真皮鞘组织消化成真皮鞘细胞和毛乳头，从而省去了在解剖显微镜下分离毛乳头的步骤，显著减少了工作量，提高了效率，而且极大地促进了毛乳头的贴壁和细胞的生长，并保证了毛乳头的完整性，且可大批量分离出毛乳头，组织化学染色表明毛乳头细胞是一种高度特异的成纤维型细胞     

压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞中bcl-2、bax及p53mRNA表达的影响

目的通过检测不同压力下纯化培养的大鼠视网膜神经节细胞(Retinal ganglioncells,RGCs)中bcl-2,bax,p53mRNA表达情况,了解压力对视网膜神经节细胞凋亡的影响.方法用SD系大鼠脑源性星型胶质细胞同化培养液双界面法[1]培养羊抗鼠Thy1.1单克隆抗体纯化的SD系大鼠RGCs;在纯化培养的RGCs上分别施加0,20mmHg,40mmHg,60mmHg和80mmHg气压,培养24h及48h后TUNEL法检测各组细胞的凋亡,原位杂交检测细胞中bcl-2,bax及p53mRNA的表达.结果纯化的RGCs培养12h及24h用羊抗鼠FITC-Thy-1.1单克隆抗体进行鉴定阳性,纯度为97%.传三代后星型胶质细胞用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体标记和鉴定阳性.培养24h组TUNEL法检测对照组极少数细胞凋亡,20mmHg组见较多细胞凋亡,随着压力的增高细胞凋亡数增多,凋亡指数增高;与对照组相比差异均有显著性.培养48h组压力≥20mmHg各组较相同压力培养24h组凋亡指数增高,差异有显著性(P＜0.05).压力≥40mmHg时bcl-2 mRNA表达逐渐减少,压力≥20mmHg时bax及p53 mRNA表达则逐渐增加;与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05).结论高于20mmHg压力时间超过24h可激活体外培养的视网膜神经节细胞的相关凋亡基因导致细胞的凋亡.     

人脂肪干细胞在体外向成脂和成软骨细胞诱导分化的实验研究

目的了解从人体抽吸的脂肪组织中获得的脂肪干细胞在体外向成脂和成软骨细胞诱导分化的情况。方法临床提取8例人脂肪抽吸组织中的间充质干细胞,在体外分别进行成脂和成软骨诱导分化,并通过油红O染色、阿尔辛蓝染色和免疫组化的方法进行证实。结果脂肪干细胞经成脂诱导后,向成脂细胞分化,细胞内出现油红O染色阳性脂滴;经成软骨诱导后,细胞向成软骨细胞分化,分泌软骨特异性基质成分硫酸蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。结论在适当的诱导条件下,来源于人体多部位脂肪抽吸组织中的干细胞具有向成脂和成软骨细胞分化的能力,本实验为进一步应用人体脂肪干细胞进行脂肪和软骨组织工程研究打下实验基础。     

黑斑蛙胃肠道嗜银细胞的分布及形态学研究

本应用Grimelius嗜银法对黑斑蛙(Pelophylax nigromaculata)胃肠道的嗜银细胞进行了研究。结果发现，嗜银细胞见于胃肠道全长，多数分布于粘膜上皮和腺泡上皮之间；其分布密度为胃幽门部最高，十二指肠部最低；嗜银细胞的形态依所在位置不同而不同。嗜银细胞具有内、外、旁分泌三种作用途径；细胞形态可能与其所受挤压情况有关。     

造血生长因子对长期培养中骨髓造血细胞增殖和分化的影响

应用骨髓长期培养法研究了ＨＧＦｓ联合应用对ＬＴＢＭＣ中造血干／祖细胞的增殖、分化的影响，结果显示，在ＬＴＢＭＣ中，含有ＨＧＦｓ（ＩＬ－２＋ＩＬ－６＋Ｇ－ＣＳＦ＋ＧＭ－ＣＳＦ＋Ｅｐｏ）的扩增组与对照组相比，ＨＧＦｓ能显著地扩增ＨＳＣｓ，在第一周，ＣＦＵ－ＧＭ，ＣＦＵ－Ｅ和ＢＦＵ－Ｅ总数分别扩增１８．０９－１６．５９倍、１０．２６－８．４８和１４．９９－１２．７８倍，而累积扩增倍数分别达３６．１９－６     

四氯化碳对非洲绿猴肾细胞损伤机理的研究

目的　实验研究四氯化碳染毒 2 4h对非洲绿猴肾细胞的损伤及其机理。方法　运用显微荧光术测定非洲绿猴肾细胞 (Vero细胞 )内活性氧 (ROS)含量及游离Ca2 + 浓度 ,同时 ,测定Vero细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力用于检查Vero细胞受损情况。结果　接触浓度为 1 0mmol L四氯化碳的Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 + 浓度与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,同时 ,表示Vero细胞受损指标 (LDH活力 )差异也无显著性 (P >0 .0 5 ) ;而接触浓度为 4 0、8.0mmol L四氯化碳的Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 + 浓度均显著性高于对照组 (P <0 .0 1) ,其Vero细胞受损也均显著性增加 (P <0 .0 1)。结论　较高浓度的四氯化碳能损伤Vero细胞 ,其损伤的可能途径是通过提高Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 + 浓度。     

c-kit在人肝硬化及肝细胞肝癌组织中的表达及意义

目的探讨肝脏祖细胞标志物c-kit在人肝硬化及肝细胞肝癌（HCC）组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法对30例肝硬化、40例肝细胞肝癌标本及3例正常组织标本进行常规组织学观察以及c-kit、CD45免疫组化染色,对肿瘤细胞的分化程度及肝硬化组织门静脉炎症程度进行分型和评分,分析c-kit表达与肝硬化及肝细胞肝癌的临床病理特征的联系。结果正常肝脏中c-kit染色阴性。20／30例肝硬化中发现c-kit（＋）细胞,位于门脉周围区域和纤维间隔内,个别阳性细胞整合到成熟胆管,肝硬化结节中没有发现c-kit（＋）细胞。19／40例HCC组织中存在c-kit （＋）肿瘤细胞,在肿瘤细胞之间或肿瘤结节周围分散分布。HBsAg及Anti-HBc在c-kit（＋）与c-kit （-）HCC之间表达有显著性差异（χ^2=5．063,P〈0．05;χ^2=6．667,P〈0．05）。c-kit表达与肿瘤的分化程度紧密相关（χ^2=10．384,P〈0．05）,分化程度越低,c-kit表达越高。结论骨髓来源的肝脏祖细胞参与了部分肝硬化病变过程中的肝再生及HCC的形成和发展,c-kit表达情况对于判断HCC预后有一定意义。