9 Survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞的抑制作用

目的:探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人肝癌细胞HepG2的抑制作用。方法:采用免疫组织化学法检测肝细胞癌（HCC）组织中survivin的表达。采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2，Western blot检测细胞survivin蛋白的表达，FCM检测细胞的凋亡率，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，观察survivin ASODN的体内抑癌作用。 结果:（1）肝癌组织中survivin表达阳性率为75.8％(25/33)，明显高于癌旁组织和正常肝组织(P<0.01);（2）survivin ASODN体外转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达，ASODN组HepG2细胞凋亡率明显高于空白对照组和SODN组(P<0.01)，ASODN组HepG2细胞在软琼脂中形成的集落数目明显少于空白对照组和SODN组(P<0.01);（3）ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(P<0.01)，ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(P<0.05)。结论:Survivin在HCC组织中高表达;survivin ASODN可以诱导HepG2细胞凋亡，在体外实验和动物实验中对HepG2细胞生长都有抑制作用。     

重组人骨形态发生蛋白4基因腺相关病毒载体对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用重组人骨形态发生蛋白4基因腺相关病毒载体(AAV-hBMP4)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其对BMSCs生物学行为的影响,从而为骨组织工程寻找理想的病毒载体及种子细胞。方法全骨髓法培养兔BMSCs,按感染复数(MOI)值不同设定为四组,分别转染兔BMSCs,观察病毒量对细胞形态的影响。选取影响最小的MOI值,进行后续实验。转染兔BMSCs,MTT法描记细胞生长曲线,观察AAV对细胞增殖活性的影响。以重组增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体(AAV-EGFP)为参照,行流式细胞仪检测,计算转染效率。AAV-hBMP4与对照病毒AAV-EGFP分别转染细胞,观察细胞形态,行碱性磷酸酶(ALP)染色、Von Kossa染色及ALP含量测定,观察成骨活性。兔肌袋实验观察异位成骨情况。结果MOI值为5×10~4 vg/cell时,AAV对细胞形态影响最小,以此值进行后续实验。AAV转染后,细胞增殖活性良好,转染效率为55％～65％。AAV-hBMP4转染后,细胞形态呈现典型的成骨改变,ALP染色及Von Kossa染色均出现成骨的特征性改变,而AAV-EGFP组无上述改变。细胞上清ALP含量测定显示,实验组ALP含量显著增高,与对照组比较差异有统计学意义(t=218．65,P＜0．01)。兔肌袋实验术后4周组织学检测可见大量钙盐沉积,矿化结节形成。结论AAV-hBMP4转染效率高,对BMSCs的增殖活性影响小,AAV-hBMP4转染的BMSCs可望成为组织工程化骨的理想种子细胞。     

基因治疗在心脏外科的作用

尽管基因治疗在实验研究方面已做了大量的工作 ,但实际上临床治疗成功的尚不多。现复习这一领域的近期文献 ,并讨论基因治疗的一些限制和潜在的问题 ,强调在心脏外科作基因治疗临床试验之前必须提请考虑的问题和规则。     

GPC3在卵巢癌中的表达及其临床意义

目的 探讨GPC3在卵巢癌中的表达及其临床意义.方法 利用实时荧光定量RT-PCR技术检测2004年1月～2005年10月手术获得的35例卵巢上皮性癌组织及23例正常卵巢组织中GPC3 mRNA的表达量,并结合卵巢癌的临床病理特点进行分析.利用Western blot技术检测4例卵巢癌组织和3例正常卵巢组织中GPC3蛋白的表达水平.结果 GPC3 mRNA在卵巢癌组织中的表达量低于正常卵巢组织(P＜0.05),部分卵巢癌组织无GPC3 mRNA表达.GPC3 mRNA的表达量与卵巢癌临床分期有关,在Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌组织中的表达量显著低于Ⅰ、Ⅱ期(P＜0.05).GPC3 mRNA与CA125在卵巢癌中的表达无相关性(P＞0.05).GPC3蛋白在正常卵巢组织中的表达水平是卵巢癌组织中的2～3倍.结论 GPC3在卵巢癌的发生发展中起着一定作用,其与CA125联合应用有可能提高卵巢癌的阳性诊断率.     

湖北地区汉族变应性哮喘患儿Tim-3启动子区基因多态性研究

目的 探讨湖北地区汉族儿童T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白．3（Tim-3）启动子区1541位C〉T和574位G〉T单核苷酸变异及其与变应性哮喘易感性之间的关系。方法 分别采用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和引物特异PCR-核酸序列测定技术检测湖北143例哮喘患儿和72名健康儿童Tim-3启动子区1541位C〉T和574位G〉T单核苷酸变异，讣算基因型和等位基因频率。结果 湖北地区健康儿童Tim-3启动子区1541位C／C、C／T和T／T基因型频率分别是0．961、0．039和0，而哮喘患儿频率分别为0．935、0．065、0，其基因型频率与对照组差异无统计学意义（r=0．3825，P=0．5362）；湖北健康儿童中Tim-3启动子区574位G／G、G／T和T／T基因型频率分别为0．992、0．008和0，而哮喘患儿频率分别为0．941、0．059、0，两组基因型频率差异有统计学意义（χ^2=4．134，P=0．042）。结论 湖北汉族儿童Tim-3启动子区存在多态性变异，其中574位G〉T多态性可能与湖北汉族儿童变应性哮喘易感性有关。     

电针镇痛的累积效应与大鼠下丘脑、海马蛋白激酶A表达变化的观察

目的:观察电针(EA)"足三里"-"阳陵泉"镇痛的累积效应,及大鼠下丘脑和海马细胞蛋白激酶A(PKA)活性的变化。方法:Wistar雌鼠68只,随机分为正常对照组、慢性压迫损伤(CCI)组、CCI+EA 2天(d)组、CCI+EA 2周(w)组、去卵巢(OVX)+CCI组、OVX+CCI+EA 2 d组、OVX+CCI+EA 2 w组。Morris水迷宫法检查OVX+D-半乳糖皮下注射动物的学习记忆能力。结扎坐骨神经造成CCI慢性痛模型,电针双侧"足三里"-"阳陵泉"穴(2/15 Hz,1~2 mA,1次/d)。用辐射热照射大鼠双侧足底引起的缩腿反应潜伏期(PWL)的差值作为痛敏分数(HS)判断动物的痛反应;用免疫组化法检测下丘脑和海马组织PKA的活性。结果:CCI术后,与正常组比较,各组HS都明显升高。在单纯CCI动物上,与CCI组比,CCI术后第18天CCI+EA 2 d、CCI+EA 2 w的HS显著减小(P<0.05);CCI+EA 2 w组的HS显著低于CCI+EA 2 d组(P<0.05)。在记忆损害的动物上,OVX+CCI+EA 2 w和OVX+CCI+EA 2 d组HS明显低于OVX+CCI组(P<0.05);而两EA组间HS差异没有显著性意义(P>0.05)。CCI+EA 2 w组下丘脑室旁核(PVN)、弓状核(ARC)和视上核(SON)区PKA的灰度值均明显低于正常对照组(P<0.05),PVN和ARC区也显著低于CCI+EA 2 d组(P<0.05);OVX+CCI+EA 2 w组PVN和SON区的PKA灰度值亦均明显低于OVX+CCI组(P<0.05)。说明EA 2 w可上调PKA的表达,且具有累积性作用。OVX+CCI+EA 2 w组ARC和SON区PKA的灰度值均显著高于CCI+EA 2 w组(P<0.05),提示EA上调PKA表达的累积效应在记忆功能减退的动物上明显减弱。海马PKA的表达与SON等下丘脑核团PKA的表达趋势类似。结论:电针镇痛有累积作用,其累积效应可能与下丘脑、海马细胞PKA的表达上调有关,并且与动物神经记忆有密切关系。     

运用siRNA建立稳定低表达IGF1R基因的肝癌细胞株的实验研究

目的运用siRNA技术在肝癌细胞株中建立稳定低表达人胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因的细胞株。方法构建包含封闭IGF1R基因的真核表达载体pSUPER-IGF1R-siRNA,转染SMMC7721和Hep3B细胞,G418筛选表达稳定的细胞株。通过RT-PCR、Western-blot分析与鉴定IGF1R mRNA和蛋白及cyclin D1、cyclinB1蛋白的表达,并绘制细胞生长曲线。结果在SMMC7721和Hep3B细胞中成功建立低表达IGF1R基因的细胞株,其生长明显减慢(P<0.05),且其cyclinD1表达亦明显下降(P<0.05)。结论pSUPER-IGF1R-siRNA能抑制SMMC7721和Hep3B细胞的生长。     

Recombinant glycoprotein based vaccine for Chandipura virus infection

Chandipura virus (CHPV) has emerged as an important pediatric encephalitis-causing pathogen with very high mortality in India. No specific vaccine or treatment is available till date. We attempted to prepare a candidate vaccine employing recombinant CHPV Glycoprotein (rGp). The Glycoprotein gene (G-gene) of CHPV was expressed using Baculovirus expression system. The rGp was purified by HPLC and used for mice immunization, 3 doses, and 4 weeks apart. One microgram rGp was found to be optimum. Sero-conversion was observed as early as 2nd week by detecting anti-CHPV IgG antibodies. Antibody titres were immunogen-concentration dependent. Intracerebral challenge of the immunized mice with 100 LD₅₀ of the homologous strain demonstrated 90% protection. In in vitro neutralization, antibodies from the immunized mice were able to neutralize heterologous viruses. There was 60% T cell proliferation observed against rGp in immunized mice. The study shows that rGp induces both arms of immune response and represents an ideal vaccine candidate for further evaluations.