腺病毒介导的β—半乳糖苷酶在小鼠气道上皮的转基因表达

目的：以β－半乳糖苷酶基因为标志基因研究重组复制缺陷腺病毒在 小鼠肺内气道上皮细胞中的转基因表达。方法：带有LacZ表达基因的重组复制缺陷腺病毒（AdCMVLacZ）,经鼻腔吸入法和气管内注射法两种途径分别感染小鼠肺组织,此后在不同时间取小鼠肺组织经多聚甲醛固定后,以X-gal染色。石蜡包埋切片后用核固红复染。结果：β－半乳糖苷酶经重组复制缺陷腺病毒AdCMVLacZ感染小鼠气道和肺泡上皮细胞,并高效表达目的基因,表达时间可长达31天,重复感染后仍可表达13天。结论：重组复制缺陷腺病毒可携带外源性基因在小鼠气道上皮细胞内进行高效、稳定和较为长期的转基因表达。     

人群中腺病毒中和抗体调查

对北京、南京、成都、海口四市１２５３份不同年龄组人群中４，７型腺病毒中和抗体进行了调查。结果，人群中４，７型腺病毒总阳性率分别为３１．０，２２．２％。不同城市人群腺病毒抗体阳性率不一，北京地区高于其他地区。７型腺病毒抗体阳性率有由南往北逐渐增高的现象，表明北方７型腺病毒感染多于南方。     

4型腺病毒载体的构建和β－半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段（７０．５－８３．０基因图谱单位）克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４（７０．５－８３）质粒，质粒ｐＡｄ４（７０．５－８３）和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂＰ腺病毒晚期表达盒，在所构建的腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ３区编码分子量为１９３００糖蛋白基因的３种Ａｄ４载体。将ｌａｃＺ基因插入载体表达区，与Ｂｅｌｌ消化的Ａｄ４ＤＮＡＡ片段共转染Ａ５４９细胞，ＯＮＰＧ法检测证实所构建的载体和表达盒功能良好。本项工作对于在国内研究口服活疫苗及开展基因治疗均具有重要意义。     

重组人内皮抑素腺病毒抗肿瘤实验研究

目的肿瘤生长具有血管依赖性。内皮抑素为胶原X羧基末端裂解片段,是重要的内源性血管抑制因子。实验中利用重组人内皮抑素腺病毒(recombinanthumanendostatinadenorirus,Ad-hEndo)在肿瘤局部给药以探索其抗血管基因治疗的可行性。方法以Ad-hEndo感染体外培养肿瘤细胞,观察重组蛋白表达及其对培养的血管内皮细胞的抑制效应;在裸鼠A549肺癌模型中瘤内注射重组病毒,观察肿瘤抑制效应、剂量依从效应和毒副反应。结果不同感染复数的Ad-hEndo感染肿瘤细胞均表达重组内皮抑素蛋白,并能抑制血管内皮细胞的生长。动物实验中Ad-hEndo治疗组肿瘤体积及肺转移结节数明显低于对照组,且转移数与治疗剂量负相关。结论以腺病毒为载体的肿瘤局部血管基因治疗能抑制肿瘤新生血管形成进而有效抑制肿瘤生长和转移,其效应具有剂量依从性。     

含不同启动子的腺病毒载体介导的人β2肾上腺素能受体基因在心肌细胞的表达

目的：观察不同的启动因子cmv,mlc-2v对腺病毒载体介导的人β2肾上腺素能受体（β2－AR）基因在大鼠心肌细胞中表达,方法：分别构建cmv,mlc-2v启动子并携带人β20－AR基因的重组腺病毒Adcmvβ2AR,Admlc,β2AR,用以感染心肌细胞,并检测心肌细胞对人β2－AR基因的表达及cAMP的含量,结果：经RT－PCR,Western免疫印迹分析证帝感染的心肌细胞均表达人β2－AR,放射性配基检测显示含mlc-2v启动子Admlcβ2AR感染的心肌细胞β2－AR密度低于含cmv启动子的A β2AR感染组（P＜0．01）,经10umol/L异丙肾上腺素作用,感染组的心肌细胞内cAMP含量明显高于对照组,感染组间存在明显差异（P＜0．01）,结论：含不同启动子的腺病毒载休感染心肌细胞后均可表达具有生物活性的人β2－AR,但两者存在差异。     

放射诱导经Egr-1启动子调控的腺病毒介导CDglyTK基因的肿瘤靶向表达

目的：构建由Egr-1基因启动子驱动CDglyTK基因表达的腺病毒载体,通过放射诱导调控CDglyTK基因的肿瘤靶向表达,用于肝癌的基因－放射治疗,方法：利用细菌内高效同源重组法,制备腺病毒载体AdEger-CD/TK.MM45T.Li肝癌细胞感染AdEger-CD/TK后,体外观察γ射线照射诱导CDglyTK基因表达及在前药5－FC、GCV存在的条件下钉对存活率的变化。利用荷瘤小鼠肝癌模型观察不同处理的抑瘤效应。结果：体外实验结果显示,γ射线照射可诱导CDglyTK基因在MM45T.Li肿瘤细胞内的表达,并呈剂量依赖性;显著增强细胞对前药5－FC、GCV的敏感性（P＜0．01）;当5－FC和GCV同时存在时具有明显的协同效应。体内抗肿瘤实验结果提示,与单纯肿瘤局部照射（TLI）、瘤内注射AdEger-CD/TK＋腹腔注射5－FC＋GCVD土产且相比,瘤内注射AdEger-CD/TK＋腹腔注射5－FC＋GCV合并TLI组的抗瘤效果最好（P＜0．01）,并可使30％的肿瘤完全消退,且未见全身毒性反应的增加,结论：利用放射调控CDglyTK基因的肿瘤靶向表达,是一种安全、有效的肿瘤基因治疗新策略。     

含不同启动子的腺病毒载体介导的人β2肾上腺素能受体基因在心肌细胞的表达

目的观察不同的启动子cmv、mlc-2v对腺病毒载体介导的人β     

瘤体注射IL-2重组腺病毒基因治疗小鼠胶质母细胞瘤及其免疫机制的初步探讨

目的：观察瘤体直接注射IL－2重组腺病毒对G422皮下荷瘤的治疗作用,对体内基因转染效率及治疗的免疫机制进行初步分析。方法：将LacZ,IL-2重组腺病毒直接注射到皮下接种的G422胶质母细胞瘤瘤体,X－gal染色检测基因转染的效率,观察肿瘤的大小和荷瘤小鼠的存活期,采用4h^51Cr释放法检测荷瘤小鼠脾细胞诱导的NK、LAK、CTL的杀伤活性,对治疗后的肿瘤进行常规病理分析。结果：采用瘤体注射腺病毒具有较高的体内基因转染效率,瘤体注射IL－2重组腺病毒对皮下建立的胶质母细胞瘤有一定的治疗作用,肿瘤的生长受抑制,荷瘤小鼠的存活期显延长,但没有长期存活小鼠。IL－2基因治疗组小鼠脾细胞的LAK、CTL杀伤活性显增强,肿瘤局部出现更多的坏死和炎性浸润细胞。结论：采用瘤体直接注射IL－2重组腺病毒对胶质母细胞瘤皮下荷瘤有治疗,其机制可能是增强了宿主的局部和全身抗肿瘤免疫反应。     

hB7-1重组腺病毒感染的肿瘤细胞的生物学特性

目的 在完成hB7-1 cDNA克隆并成功构建包含hB7-1基因的重组腺病毒rAdexl-B7－1的基础上,对经rAdexl-B7－1感染的B16细胞的体外生物学特性进行了研究。方法 以FACS、电镜等方法观察病毒感染前后B16细胞的变化。结果 ①重组腺病毒经KEK293细胞扩增、CsCl纯化后滴度可达10^10ＰＦＵ／ml,且２０ＭＯＩ的病毒可使９５％以上的Ｂ１６细胞被感染。②细胞动力学研究显示,rAdexl-B7-1对Ｂ１６的生长及集落形成能力无影响。③ＦＡＣＳ结果表明,rAdexl-B7-1细胞的增殖周期无影响。④扫描电镜及透射电镜结果表明,经rAdexl-B7-1感染的Ｂ１６细胞在表面形态及超微结构上出现变化。结论 重组腺病毒rAdexl-B7-1对Ｂ１６细胞的生长动力学无影响,对形态学有轻微影响。