特异性抗SSA/Ro噬菌体抗体的制备及其基因序列分析

目的　由已构建的人源单链可变区噬菌体抗体库中制备出抗SSA/Ro单克隆抗体 ,并对这些抗体的基因序列进行分析。方法　将冻存的抗体库菌种复苏制备噬菌体抗体库。用PCR、基因序列分析及酶切的方法对其进行鉴定。以组织培养皿法对该噬菌体抗体库进行富集筛选 ,用ELISA方法对富集后次级抗体库进行鉴定。制备单克隆抗体并鉴定其特异性 ,对单克隆抗体的可变区基因序列进行测序分析。结果　所制备的噬菌体抗体库的滴度为 1 6× 10 12 cfu/ml,外源基因的插入重组率为 80 % ,插入片断为人抗体可变区基因 ,且该抗体库具有良好的多样性。富集筛选回收的噬菌体数逐渐增加 ,富集后的抗SSA/Ro噬菌体抗体次级库吸光度 (A)值为富集前的 2 8倍 ,且该次级库有良好的抗SSA/Ro特异性。经富集制备出 5个特异性抗SSA/Ro单克隆抗体 ,这些单克隆抗体重链及轻链可变区基因分别与VH1、VH3、VH4、Vκ1、Vκ2、Vκ3基因家族有高度同源性。结论　本实验室构建的scFv噬菌体抗体库可以用于特异性抗体的筛选及单克隆抗体的制备。制备出的抗SSA/Ro单克隆抗体可变区基因序列与人胚系基因比较有突变 ,为研究相关疾病的发病机理开创了新的途径     

20条SARS病毒全基因组序列的突变分析：负选择作用于复制酶ORF1b和spike基因的证据

AIM: Recently, more SARS-CoV virus genome sequences are released to the GenBank database, The aim of thisstudy is to reveal the evolution forces of SARS-CoV virus by analyzing the nucleotide mutations in these sequences.METHODS: We obtained 20 SARS-CoV virus genome sequences from NCBI database, and calculated the ratio ofnon-synonymous nucleotide substitution per non-synonymous site (Ka) and synonymous nucleotide substitutionper synonymous site (Ks) for SARS-CoV virus genes. RESULTS: The Ka/Ks ratios for replicase polyprotein ORF1a,ORF1b, and spike protein gene are 1.09 (P=0.6501), 0.38 (P=0.0074), 0.65 (P=0.0685) respectively.CONCLUSION: SARS-CoV virus replicase polyprotein ORFlb is undergoing negative selection; negative selectionforce is also probably operating on spike protein gene. These results provide basis for future developing a new drugand vaccine against SARS.     

肠道病毒中枢神经系统感染患儿脑脊液中VP1序列的分子分型研究

目的 探讨肠道病毒(EV)中枢神经系统感染患儿脑脊液(CSF)中VP1序列分子分型研究的临床价值.方法 2003年1月至2005年12月青岛大学附属医院和滨州医学院附属医院采用通用引物和VP1段分子分型引物分别对63例无菌性脑膜炎和脑炎惠儿急性期和恢复期的CSF标本进行扩增,对VP1分型引物扩增阳性片段进行克隆、测序及分型研究.结果 采用通用引物经2次PCR检测急性期患儿的CSF标本共47例(47/63,74.6%)阳性,恢复期仅3例(3/57,5.3%)阳性.采用分型引物经2次PCR检测通用引物扩增阳性的47例急性期的CSF标本共3l例(62.0%)阳性,其中4例脑炎和20例脑膜炎进行了序列测定.测序结果通过BLAST软件进行同源性对比分析,发现同-型别内序列同源性在97%～99%,不同型别之间同源性只有74%～76%,其中COX B3(9例)、ECHO 12(7例)、ECHO 30(3例)、COX A7(2例)、COX A9(1例)、COX B5(1例)、COX A11(1例).所有CSF进行病毒分离,11例(11/63,17.5%)阳性,阳性率明显低于VP1段分子分型的检测结果,除1例CSF标本病毒分离为ECHO7的患儿,通用引物扩增阳性而VP1分型引物扩增失败外,其余血清型别与VP1段分子分型研究结果完全-致.结论 EV是儿童无菌性脑膜炎和脑炎最重要的病原体;采用通用引物所建的RTPCR是快速检测EV中枢神经系统感染的有效方法;分型引物扩增VP1部分序列并测序,与GENBANK中的EV标准毒株进行对比,根据基因序列的同源性进行EV分型,为EV的分型研究提供了新的方法和思路.     

基因多态性对器官移植中免疫抑制剂疗效影响的研究进展

环孢素、他克莫司、雷帕霉素和霉酚酸酯都是广泛用于器官移植患者的免疫抑制剂，他们具有治疗指数窄、个体差异大的特点。环孢素、他克莫司和雷帕霉素主要通过肝脏和小肠的CYP3A代谢；同时他们又是药物转运体的底物。霉酚酸酯是通过葡萄糖醛酸转移酶代谢。不同个体间药物代谢酶和转运体活性的差异，可能是造成不同器官移植患者对以上药物药代动力学差异的主要原因；而遗传因素即编码药物代谢酶和转运体基因序列的差异，可能是其产生活性差异的分子机制。因此，从编码药物代谢酶和转运体的基因入手，可能会为器官移植患者提供最优的治疗方案。     

流感病毒A/FM/47(H1N1)血凝素基因克隆、序列分析

目的对流感病毒A/Font Monmouth/47(H1N1)血凝素基因进行变异分析。方法用SPF鸡胚增殖毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术扩增该病毒株的HA基因,并克隆到pMD18-T载体上,测定HA基因核苷酸序列。结果该毒株的HA基因全长为1677bp,含有完整的阅读框架,编码545个氨基酸;BLAST序列比对结果显示,该毒株HA基因与其他H1基因核苷酸的同源性为98%。结论该毒株HA核苷酸序列发生了变异,出现多处碱基替换,可能是病毒毒力增强的原因。     

Sequence determination of exp- 1 Gene of Plasmodium Falciparum Isolate FCC1／HN

目的 测定恶性疟原虫FCCl／HN株exp-1基因序列。方法 根据exp-1基因已知序列设计合成1对引物，用PCR技术从FCCl／HN株基因组DNA中扩增exp-1基因；将exp-1基因克隆入pMD-18T载体，转化大肠杆菌JMl09感受态细胞，铺x—gal LB平板；挑取阳性菌落，用酶切，PCR扩增进行鉴定。以正确的重组质粒为模板，用双脱氧链末端终止法测定exp-1基因序列。结果 从恶性疟原虫FCCl／HN株基因组DNA中获取exp-1基因，成功克隆入pMD-18T载体；测序表明FCCl／HN株exp-1基因全长937bp，编码162个氨基酸。结论 克隆了恶性疟原虫FCCl／HN株exp-1基因，并测定了其核苷酸序列，为进-步研究其功能奠定基础。     

寡核苷酸探针芯片快速进行原肺癌P53序列分析

对 10 0种人类原肺癌的Ｐ5 3序列应用双脱氧循环测序和应用Ｐ5 3基因芯片进行测序进行比较 ,评估这两种不同的测序技术的差别 ,以确定这两种方法的准确性和局限性 .Ｐ5 3基因的变异即可用这两种技术来测得 ,也可用其中的一种技术来测得 ,已经应用特异变异的寡核苷酸杂交进行了验证 .对Ｐ5 3基因的保守区域 (外显子 5 - 9)应用双脱氧测序得到这一区域的变异为 76 % .Ｐ5 3基因芯片检测的结果为所有 (外显子 2 - 11)的变异为 81% ,其中包括保守区的 80 % .基因芯片检测的 5 2个变异中有 4 6个无义变异 (88% ) ,5个依框变异为 0 .直接测序和基…     

肝癌中AKRlC2基因序列及其表达研究

目的：研究肝癌中AKRlC2基因序列及其表达。方法：利用RT-PCR等扩增肝癌及其癌旁组织中AKRlC2基因，并将其接入pGEM-T Easy载体中进行测序。结果：肝癌中AKRlC2序列与鼠中AKRlC2的同源性达82％：肝癌中该基因表达强于癌旁组织。结论：AKRlC2基因可能与肝癌发生有关，为-上调基因。     

从4例肝炎病人分离的输血传播病毒基因分析

目的 测定从4例肝炎病人分离的输血传播病毒的（TTV）基因序列，观察临其临床特点。方法 利用PCR技术提取1999-2001年检出的4例TTV患者血清中DNA，进行基因分型。结果 H1、H2株与TX011同源性较大，H3、H4株与TA278、N22、CHN1、TX011、TS003、NA004的序列差异均较大，H3与H4之间的差异也较大。4例患者的丙氨酸氨基转移酶（ALT）均升高。结论 H1、H2属1b型，具有一定毒性，H3、H4为新的基因型或变异株，二者亦不同型，均具有较强的毒性。     

旋毛虫肌幼虫p45cDNA的克隆及鉴定

目的本研究根据GenBank中旋毛虫45kDa抗原基因的序列设计引物,采用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p45cDNA,并克隆到pMD-18T载体,转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析。获得827bp的p45cD-NA。该序列与GenBank中的旋毛虫p45基因序列相比共有1个核苷酸发生改变,二者的同源性为99%,其编码蛋白质由268个氨基酸组成,与45kDa抗原的同源性为99%。将p45cDNA克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star（DE3）后,经IPTG诱导表达出约30kDa的重组蛋白。Western-blot检测表明,p45重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别,具有良好的抗原性。