重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化

目的 基于重叠延伸PCR（SOE PCR）技术构建转录因子EB（TFEB）丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。 方法 根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_n和R_n进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌（E.coli）中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。 结果 第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸（TCT）成功突变为丙氨酸（GCT）。在0.5?mmol·L^－1 IPTG、16?℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。 结论 利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达。     

2种测定血清丙氨酸氨基转移酶方法的比较

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定项目是常用检测肝功能的试验,在健康人群体检中作为了解肝功能情况的主要指标之一,以前一直使用赖氏法检测,该方法存在着血清需要量大、检测时间长、操作步骤多、每批试剂都需要绘制标准曲线等缺点;在健康人群体检时标本数量很大,需要一种能够简便、快速、准确的适合大量筛选的检测方法。然而用丙酮酸氧化酶法测定ALT ,具有血清用量小、检测时间短、步骤简单、无需绘制标准曲线等优点,可以作为体检筛选ALT的好方法。一、材料和方法1.标本来源　随机抽取体检血清标本4 0份。2 .试剂来源　赖氏法检测试剂和…     

复方阿胶浆质量标准提升研究

目的提升复方阿胶浆质量标准。方法基于中药复方制剂"整体鉴别"新模式,对复方阿胶浆中植物来源中药采用一板多鉴法,红参、党参使用同一供试品溶液、同一展开剂,采用对照品和对照药材双对照(红参使用人参皂苷Rg_1对照品和红参对照药材;党参使用党参炔苷对照品和党参对照药材)进行鉴别;熟地黄、山楂使用2种供试品溶液、同一展开剂,采用对照品和对照药材双对照(熟地黄使用毛蕊花糖苷对照品和熟地黄对照药材;山楂使用牡荆素鼠李糖苷对照品和山楂对照药材)进行鉴别。对复方阿胶浆中动物药阿胶建立L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸4种氨基酸含量测定。并采用一测多评法,以L-羟脯氨酸为内标,确定甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的相对校正因子并计算含量。结果建立了复方阿胶浆中植物药鉴别的"4-3-2-2"模式,即4味中药,3种供试品溶液制备方法、2种展开剂,2种对照物的双对照方法,斑点清晰且专属性强。建立了复方阿胶浆中动物药阿胶一测多评法含量测定,15批样品中L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的质量浓度分别为2.73～3.37、4.61～6.99、2.64～3.97、3.58～4.46 mg/mL。以L-羟脯氨酸为内标建立的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的相对校正因子分别为0.651、0.958、0.857。采用t检验、相对偏差法和Pearson相关系数法对2种方法的含量测定结果进行比较分析,15批复方阿胶浆一测多评法计算值与外标法实测含量值无显著差异。结论建立了复方阿胶浆中植物药来源中药鉴别的"4-3-2-2"模式。对处方中动物来源中药阿胶建立了4种氨基酸的一测多评法含量测定。通过"一板、一测",达到"多鉴、多评"整体药味质量控制的目的,科学合理地提升复方阿胶浆的质量标准。     

4142名正常人血清ALT测定结果及其参考区间

血清丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ，ＥＣ２．６，１．２）是临床诊断肝功能的一项重要检测指标，以前多使用赖氏法，随着自动化分析仪器的普及，现在各医院检验科或实验室大多采用酶联法测定ＡＬＴ，由于采用不同的试剂，测定的参考区间各不相同，我院应用科华－东菱诊断用品公司的试剂和日立７１７０Ａ自动生化分析仪，对４１４２名体检健康人进行了血清ＡＬＴ测定，其中男性２１９９名，女性１９４３名，年龄２０～８０岁，结果表明：血清     

丙氨酸氨基转移酶测定波长设置的实验研究

目的观察波长设置对含有不同干扰物丙氨酸氨基转移酶（ALT）标本测定的影响。方法对NADH纯品溶液、试剂样本及含不同干扰物的样品进行全波长扫描。依据吸收曲线设定不同的副波长,然后对含不同干扰物的定值血清进行测定,以定值血清所给的值为参照,确定最佳波长组合。结果定值血清测量结果,单波长340nm与双波长（340/380nm,340/404nm）差异无统计学意义（P〉0.05）;血红蛋白（Hb）和胆红素（BIL）干扰的ALT标本,340/404nm测定结果与靶值差异无统计学意义（P〉0.05）,340/380nm测定结果与靶值差异有统计学意义（tHb=2.144,PHb=0.042〈0.05;tBIL=2.453,PBIL〈0.05）;血脂（TG）干扰的ALT标本340/380nm测定结果与靶值差异无统计学意义（P〉0.05）,而340/404nm测定结果与靶值差异有统计学意义（t=-3.338,P〈0.01）。结论利用单波长即可准确测得低干扰程度丙氨酸氨基转移酶（ALT）标本的活性。若采用双波长时应视标本干扰物的种类而选择不同双波长,溶血、黄疸干扰应选择340/404nm,血脂干扰应选择340/380nm。     

APP、MAO和ADA在肝酶学检测中的临床应用探讨

实验室反映肝功能的酶学指标在肝病的诊断治疗中一直起着非常重要的作用,有一些酶学指标在临床上已经被广泛应用,成为许多医院检验科常规检验项目。我们共收集102例肝病患者和80例正常人的血清,分别检测丙氨酸氨基肽酶(AAP),单胺氧化酶(MAO),腺苷脱氨酶(ADA),探讨3种酶活性在肝     

佛山市南海区无偿献血者ALT不合格结果分析

丙氨酸氨基转移酶（ALT）是临床评价肝功能的指标之一，同时也是我国血站基本标准中献血者健康检查标准之一。ALT的检测方法目前在血站系统常用的方法主要有赖氏方、连续监测法、改良的微板速率法和快速干式生化法等。本站采用全自动生化分析仪，应用连续监测法做ALT的检测。针对ALT不合格及HBsAg、抗-HCV、抗-HIV和梅毒抗体（TP）相关检测指标情况进行统计分析。     

珍珠梅提取物对四氯化碳所致大鼠急性肝损伤的保护作用

目的：研究珍珠梅乙酸乙醇提取物对CCl4所致大鼠急性肝损伤的保护作用。方法：给动物ig给药，用CCl4造大鼠急性肝损伤模型，用比色分析法测定大鼠血清天冬氨酸转氨酶(aspartate rtansaminase,ALT)、丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,AST)的活性；在大鼠血清、肝匀浆、肝线粒体测定超氧化歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione perioxidase,GSH)。结果：珍珠梅能显著降低因CCl4所致急性肝损伤大鼠血清ALT、AST的升高；明显回升CCl4所致肝损伤大鼠肝线粒体SDH活性的降低；对急性肝损伤大鼠血清、肝匀桨、肝线粒体SOD、GSH—PX的活性有明显的升高作用及降低MDA的含量。结论：珍珠梅乙酸乙酯提取物对CCl4所致大鼠急性肝损伤有保护作用。     

注射HBsAg-SCT质粒的HBV转基因小鼠血清转氨酶的检测分析

目的研究注射HBsAg-SCT质粒的HBV转基因小鼠血清中转氨酶水平的变化。方法选取遗传背景相同的HBsAg阴性正常鼠30只作为正常对照组,HBV转基因鼠30只为实验1组,注射HBsAg-SCT质粒的HBV转基因小鼠30只为实验2组。采集各组小鼠在8周龄时的血液,用全自动的生化分析仪检测小鼠血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平。结果实验1组(HBV转基因小鼠未注射HBsAg-SCT质粒组)和实验2组(HBV转基因小鼠注射HBsAg-SCT质粒组)小鼠的血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶与正常对照组比较,均显著升高(P<0.01);实验1组小鼠的血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶与实验2组比较,无明显差异(P>0.05)。结论注射HBsAg-SCT质粒的HBV转基因小鼠血清转氨酶水平明显高于正常小鼠;但与未注射HBsAg-SCT质粒HBV转基因小鼠无明显差异。     

肝脏硬度检测联合吲哚菁绿滞留率测定对血清转氨酶正常或轻度升高的慢性乙型肝炎患者肝组织学病变进展的预测价值

目的 探讨肝硬度检测(LSM)和吲哚菁绿15分钟血浆滞留率(ICGR15)对慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织病理学损伤的预测价值。方法 2016年7月～2018年11月我院诊治的血清 ALT正常或＜2 倍正常值上限(ULN)的CHB患者,接受肝活检行METAVIR评分,依据评分分为非进展期和进展期。使用日本光电工业株式会社生产的DDG-3300K脉动脉式色素浓度分析仪检测ICGR15,使用Echosens 502肝脏瞬时弹性成像仪检测LSM。应用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)评估指标预测肝组织病变进展的效能。结果 经肝组织学检查,发现肝组织进展期196例,非进展期113例,两组年龄、性别、血小板计数、血清HBeAg阳性是否阳性和血清ALT水平无显著性差异(P>0.05),而进展期患者血清HBV DNA、ALB、LSM和ICGR15与非进展期患者比,差异显著(P<0.05);LSM、ICGR15及LSM-ICGR15联合模型与METAVIR评分均存在正相关性(P值均<0.05);ROC曲线分析显示LSM 、ICGR15和LSM-ICGR15联合模型预测肝组织进展期的曲线下面积(AUC)分别为0.655、0.617和0.686。当 以LSM等于7.35 kPa为截断点,其诊断肝组织进展期的灵敏度为55.4%,特异性为68.1%,当以ICGR15等于4.15%为截断点,其诊断肝组织进展期的灵敏度为34.4%,特异性为90.3%,以LSM-ICGR15联合预测的灵敏度为59.5%,特异性为78.8%。结论 应用LSM、ICG-R15或者两者联合预测血清ALT正常或轻度升高的CHB患者肝组织病变进展有一定的价值,值得临床进一步研究。