转基因细胞移植对损伤脊髓天门冬氨酸受体的影响

[目的]研究腺病毒介导的脑源性神经生长因子(brainderivedneurotrophinfactor,AxCABDNF)转基因细胞移植和大剂量甲基强的松龙对大鼠损伤脊髓组织N甲基D天门冬氨酸(NMDA)受体的影响。将成年大鼠分为4组,A组单纯脊髓损伤组;B组脊髓损伤+AxCABDNF基因转染的成肌细胞移植组;C组脊髓损伤+甲基强的松龙组;D组脊髓损伤+细胞移植+甲基强的松龙组。应用后1、3、7、14d,采用[3H]标记的地卓西平马来酸盐([3H]MK801)放射性配基分析法检测大鼠损伤后脊髓NMDA受体的变化。[结果]发现各组[3H]MK801放射性配基分析最大结合容量都有不同程度的减少,其减少程度顺序是A组>B组>C组>D组。表明应用甲基强的松龙(MP)和BDNF转基因细胞移植可以通过影响脊髓NMDA受体减轻脊髓继发性损伤。     

The use of FISH in chromosomal localization of transgenes in rice

Chromosomal location and local chromatin structure are thought to play important roles in the stability of transgene expression. Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a cytogenetic technique that allows the localization of specific DNA sequences on chromosomes. It provides an excellent means to analyze the chromosomal environment of integrated transgenes, helping to assess the effect of position on gene expression. FISH analyses have been conducted on nuclear chromosomal DNA at metaphase, interphase, meiotic prophase (pachytene) and on extended chromatin fibers (DNA fiber-FISH) and naked DNA molecules. Despite the small size of rice chromosomes, FISH has been successfully accomplished to detect unique and repetitive DNA sequences. A detailed FISH procedure for the detection of small and single copy transgenes within the rice genome is described and the application of FISH to evaluate chromosomal location and the local chromatin structure of transgenes as parameters that could affect their expression is discussed.     

牛卵丘细胞的生长特征与转基因

目的了解牛卵丘细胞的生长特征及构建的基因载体对卵丘细胞的转染情况和转染后阳性细胞的扩增效率。方法用透明质酸酶消化牛卵丘/卵母细胞复合体(COCs)获得牛卵丘细胞,了解牛卵丘细胞的生长特点,并用分子大小分别为7178 bp和31 085 bp两种带有增强绿色荧光蛋白(EGFP)和新霉素抗性基因(Neor)的质粒载体pMSCV-EGFP-Neor和pGC1-collagen-EGFP-Neor分别转染靶细胞。结果用脂质体法转染对数生长期的细胞,均获得了绿色荧光阳性细胞,但小质粒的转染效率在72 h时是大质粒的6倍(14%vs.2.3%)。在800μg/mLG418筛选浓度下,14 d后分别获得了7个和3个较明显的单克隆细胞群,对它们进行挑选、扩大,都获得了较纯的单克隆细胞系。最后根据EGFP和collagen的已知基因序列对转染pGC1-collagen-EGFP-Neor质粒的阳性细胞进行三个不同区域DNA片段的扩增,结果表明,扩增的基因片段大小正确,数目完整。结论对卵丘细胞进行基因转染,分子大小等于或小于31 kb的基因可以有效转入,但小分子载体比大分子载体具有更高的转染效率。经过筛选都可以获得纯的转基因细胞...     

一种在紫外敏感型视锥细胞中特异表达tdTomato的转基因斑马鱼系的构建

目的 鉴于目前对斑马鱼视锥细胞视蛋白运输机制并不明确,且缺乏相应的抗体,本实验拟构建一种可以在视锥细胞中特异表达荧光的转基因斑马鱼。方法 我们利用编码紫外敏感型视蛋白基因（sws1）的启动子,构建了一种在紫外敏感型视锥细胞中特异表达红色荧光蛋白tdTomato的转基因斑马鱼。与此同时,我们将tdTomato荧光蛋白与非洲爪蟾Rhodopsin蛋白末端44个氨基酸相融合,将该融合蛋白定位于紫外敏感型视锥细胞的外节段,进而可模拟内源性视蛋白的定位。结果 我们共筛选出三种不同品系的转基因斑马鱼,经过免疫组化分析,确定其中一种转基因品系是正确的目标品系。结论 该转基因斑马鱼的构建将会为进一步研究视锥细胞中视蛋白的运输机制提供帮助。     

Cyclooxygenasen in der Haut

Cyclooxygenases (COX)‐1 and COX‐2 catalyse the key steps of prostaglandin biosynthesis and are the major target for non‐steroidal anti‐inflammatory drugs. In general, COX‐1 but not COX‐2 is expressed in healthy tissues of adults. After incision or acute irritant dermatitis, COX‐2 is induced transiently. The development of UV‐induced erythema and edema as well as of skin tumours is significantly governed by COX‐2 activity. Squamous cell carcinomas and actinic keratoses are prominent examples of epithelial tumours with COX‐2 overexpression in the tumour parenchyma, inflammatory infiltrate and associated vessels. According to multi‐stage carcinogenesis studies in mouse skin and experiments with transgenic mice, there is a causal relationship between aberrant COX‐2 expression and activity in the epithelium and tumour promotion and tumour progression. The transgenic overexpression of COX‐2 causes an “autopromoted” skin phenotype, i. e. it dramatically sensitizes the tissue for the development of squamous cell carcinomas. Vice versa, the genetic ablation of COX‐2, as well as of COX‐1, results in a reduced tumour burden in murine skin. A major mechanism by which COX‐2 contributes to epidermal tumour formation seems to be the disturbance of terminal keratinocyte differentiation. Because of these data, selective COX‐2 inhibitors are ranked among the most promising agents for skin cancer prevention and therapy.     

转基因修复椎间盘细胞外基质的研究进展

目的综述转基因修复退变椎间盘细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的发展及研究进展。方法广泛查阅近年来有关转基因调节椎间盘ECM合成和分解的国内外文献,并进行综述。结果椎间盘正常的形态、功能与ECM的合成、降解密切相关。ECM已经成为转基因修复退变椎间盘的标靶。转基因治疗目前在载体的选择、靶基因的转导、转入基因的调控与安全性等多方面取得明显进展。结论转基因修复退变椎间盘是治疗椎间盘退变性疾病的重点研究方向。     

转基因水牛人FSHβ基因突变的研究

目的:检测转基因水牛人FSHβcDNA序列基因。方法:分离提取转基因水牛外周血DNA,PCR扩增,T-A克隆测序,DNAclub软件分析。结果:水牛基因组整合人FSHβcDNA序列并发生一位点缺失C44(无意义链)或G347(有意义链),突变位于人FSHβ-Seatbelt结构域。结论:转基因水牛整合人FSHβcDNA序列发生点缺失,导致阅读框架发生移码,其功能有待进一步研究。     

慢病毒介导APP695基因RNAi对体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元β淀粉样蛋白分泌的影响

目的 探讨慢病毒介导RNA干扰(RNAi)抑制APP695基因表达对体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元细胞分泌β淀粉样蛋白(Aβ)的影响.方法 构建靶向APP695基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒表达质粒(pFU-GW-iRNA),进行酶切和测序鉴定.慢病毒表达质粒与包装质粒(pHelper 1.0和Helper 2.0)共转染293T细胞,获得病毒浓缩液并测定滴度.使用APP695-shRNA慢病毒载体感染体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元,设定为慢病毒介导阳性干扰(APP695-RNAi)组,另设阴性对照病毒感染(NC)组、未经病毒感染(CON)组.采用实时荧光定量PCR检测APP695基因mRNA的表达,Western印迹检测APP695蛋白的表达,采用Elisa检测Aβ40和Aβ42的生成.结果 PCR扩增和测序结果证实,APP695 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为5×108 TU/ml.使用慢病毒载体感染体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元,实时荧光定量PCR检测APP695-RNAi组APP695基因mRNA的抑制率为76.70%,与NC组和CON组相比差异有统计学意义(P＜0.001).Western印迹结果显示蛋白水平表达下降与定量PCR一致.Elisa检测干扰72 h后APP695-RNAi组、NC组、CON组Aβ40的分泌分别为(184±15)ng/L、(647±30)ng/L、(656±40)ng/L.APP695-RNAi组与NC组和CON比较差异均有统计学意义(均为P＜0.001);APP695-RNAi组、NC组、CON组Aβ42的分泌分别为(19.2±1.9)ng/L、(67.6±6.0)ng/L、(68.6±7.0)ng/L.APP695-RNAi组与NC组和CON比较差异均有统计学意义(均为P＜0.001).结论 慢病毒载体介导的APP695基因RNA干扰可以有效抑制痴呆小鼠皮质神经元细胞Aβ40和Aβ42的分泌.     

四氯化碳/乙醇诱导乙型肝炎病毒转基因小鼠发生肝纤维化与肝癌的实验观察

目的 观察四氯化碳/乙醇诱导乙型肝炎病毒转基因小鼠实验性肝纤维化和肝癌的过程.方法 采用四氯化碳/乙醇分别诱导野生型小鼠、乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)转基因小鼠、HBsAg转基因小鼠20周,观察每组小鼠发生肝纤维化和肝癌的情况,并采用RT-PCR方法检测HBx及HBsAg基因的表达.结果 转基因小鼠肝脏有HBx或HBsAg基因表达,而野生型小鼠则没有.3组小鼠之间及雌、雄性之间发生肝纤维化的程度差异无统计学意义.四氯化碳/乙醇诱导显著加快了HBx和HBsAg转基因小鼠发生实验性肝癌的进程,雄性小鼠肝癌发生率显著高于雌性小鼠.结论 HBx和HBsAg基因整合进小鼠肝脏细胞内并不能增加肝纤维化程度,但能促进肝癌的发生发展;雄性小鼠较雌性更易发生肝癌;四氯化碳/乙醇诱导能显著促进乙型肝炎病毒转基因小鼠发生肝癌.四氯化碳/乙醇诱导乙型肝炎病毒转基因小鼠形成肝癌是一个较好的肝癌动物模型.