转化生长因子β1基因转染对大鼠骨髓树突状细胞免疫功能的影响

目的 研究人转化生长因子β1(TGFβ1)基因修饰对大鼠骨髓树突状细胞(DC)免疫功能的影响。方法 构建TGFβ1-pcDNA3质粒并转染未成熟DC。检测转染后DC的TGFβ1表达及其功能变化，输注1周后柃测TGFβ1-DC在受者脾和淋巴结的分布、T细胞凋亡水平及T细胞端粒酶表达。结果 TGFβ1-pcDNA3质粒转染DC能有效抑制DC的成熟和分化，并下调Dc的多种功能。TGFβ1基因转染不仅能降低DC对LPS的反应，同时抑制DC在MLR中刺激T细胞增殖的能力。TGFβ1-DC输注受者后，1周内可在脾和淋巴结内形成微嵌合，并有效诱导T细胞的凋亡，抑制T细胞端粒酶的活性和表达。结论 TGFβ1基因能有效抑制DC的多种功能，可用于诱导机体免疫耐受。     

转染人BTLA基因细胞株的建立及其生物学功能的初步研究

目的:构建B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因转染的细胞作为免疫原,并探讨该基因转染细胞在体外的生物学功能。方法:通过RT-PCR法从经PHA活化的人外周血T细胞中克隆出人BTLA编码区全长基因,经EcoR I和BamHI双酶切后插入逆转录病毒载体pEGZ-Term中构建成重组载体pEGZ-Term/BTLA。用脂质体法以重组逆转录病毒载体转染293T细胞,并用Zeocin抗生素进行长期筛选;流式细胞术分析BTLA在基因转染细胞膜上的表达;通过MTT法和流式细胞术探讨基因转染细胞在体外对T淋巴细胞增殖与活化的影响。结果:流式细胞术检测表明BTLA基因转染的293T细胞膜上能稳定地高表达人BTLA蛋白。BTLA基因转染的293T细胞和T细胞体外共培养显示,与未转染的293T细胞相比,该基因转染的细胞能部分地抑制抗人CD3单克隆抗体(mAb)刺激的T细胞增殖;流式细胞术和ELISA法分析揭示,该基因转染的细胞能够下调T细胞表面活化标志CD25的表达并降低IFN-γ和IL-10的分泌。结论:获得稳定高表达人BTLA基因转染的细胞株。该细胞株在体外对抗人CD3 mAb刺激的T细胞的增殖与活化具有部分地抑制作用。     

血管内皮生长因子反义基因转染对高转移人巨细胞肺癌细胞系生 …

目的 探讨反义血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因转染在抑制恶性肿瘤生长和转移的抗肿瘤血管基因治疗中的意义。方法 利用基因重组技术构建正义和反义ＶＥＧＦ１２１ ｃＤＮＡ真核表达载体,用脂质体法转染高转移性人巨细胞肺癌细胞（ＰＧ）,经Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹免疫化学检测ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ和蛋白质的表达水平,并对转染前后细胞进行体外生长和裸鼠体内生长转移等多项生物学行为实验,结果 转染反义转     

多药耐药基因修饰的小鼠骨髓细胞对造血功能的保护作用

目的:将体外转染了人多药耐药基因(MDR1)的小鼠骨髓细胞,移植给经致死剂量照射的受体小鼠,观察该基因对小鼠造血功能的保护作用。方法:分离经5-Fu预处理的供体小鼠骨髓有核细胞,体外转染由逆转录病毒介导的人多药耐药基因MDR1,然后移植给经85Gy致死剂量照射的同系受体小鼠,以紫杉醇(Taxol)、长春新碱(VCR)、柔红霉素(DNR)筛选,观察小鼠血象、生存期和生存率变化,应用聚合酶链反应(PCR)和流式细胞仪(FCM)分析人多药耐药基因在小鼠中的整合与表达。结果:致死剂量辐照后,移植组小鼠造血功能逐渐恢复,未移植组15d内全部死亡。腹腔注射紫杉醇或静脉注射长春新碱、柔红霉素后,实验组生存率和生存期明显高于对照组(P<005)。表明MDR1基因能保护骨髓细胞,并且具有体内选择和富集作用,PCR分析提示,实验组外周血、骨髓、肝、脾组织中均检测到原病毒整合,RT-PCR与FCM检测到MDR1基因表达。结论:人MDR1基因修饰的小鼠骨髓细胞,能有效重建经致死剂量照射的受体小鼠造血功能,一定程度上保护骨髓免受化疗药物所致的细胞毒性作用。     

不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞诱导PBMC增殖和杀伤肿瘤细胞的影响

目的 研究不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞诱导外周血单个核细胞(PBMC)增殖和杀伤肿瘤细胞的影响.方法 野生型NCI-H446细胞(Cw)和被3种IL-15基因分别转染的3种NCI-H446细胞(Cmp:被IL-15成熟肽基因转染;Cp:被原型IL-15基因转染;Csp:被信号肽换为IL-2信号肽的改型IL-15基因转染),用丝裂霉素(M)处理后(分别名为MCw、MCmp、MCp和MCsp)作为刺激细胞刺激健康志愿者的PBMC.对这些被刺激的PBMC,分别名为MCw-PBMC、MCmp-PBMC、MCp-PBMC和MC-sp-PBMC.台盼蓝拒染法计数细胞数,流式细胞术测定CD4 细胞和CD8 细胞百分率.在MCmp-PBMC,MCp-PBMC和MCsp-PBMC中,选择其细胞数和CD4 细胞和/或CD8 细胞百分率统计学上明显高于MCw-PBMC的作为效应细胞,MTT法测定它们对Cw的杀伤.结果 与MCw-PBMC相比,MCp-PBMC在细胞数、CD4 细胞和CD8 细胞百分率及对Cw的杀伤上,均显著提高(P＜0.05).结论 原型IL-15基因转染能提高NCI-H446细胞诱导PBMC增殖和杀伤野生型NCI-H446细胞的能力.     

以报告基因荧光素酶研究HPRE功能元件与IFN-α应答的关系

目的:以荧光素酶(luciferase,LUC)基因为报告基因,探讨HBV转录后调节序列(HPRE)的功能元件(α、β1和β2)对IFNα作用的影响。方法:用PCR法从载体pGEMluc中扩增LUC基因,并克隆入真核表达载体pcDNA3.0中。以含乙肝病毒(HBV)基因组的质粒A01为模板,扩增HPRE(完整的HPRE)、HPREαβ1及HPREβ1β2片段,并分别插入LUC基因的下游。利用脂质体介导的转染法,将重组质粒分别导入人肝癌细胞株HepG2中,用LUC检测系统检测IFNα作用前后LUC表达活性的变化。结果:经测序证实,重组质粒pcDNA3.0luc、pcDNA3.0lucHPRE、pcDNA3.0lucHPREαβ1及pcDNA3.0lucHPREβ1β2构建成功。检测结果显示,IFNα作用前,HPRE、HPREαβ1和HPREβ1β2均能提高LUC的活性,IFNα作用后,HPRE和HPREβ1β2能明显降低LUC的活性,而HPREαβ1对其表达则没有显著影响。结论:HPRE的功能元件β2与IFNα作用的关系最为密切,而功能元件α和β1在IFNα应答中作用甚小,提示IFNα诱导产生的HPRE抑制性结合蛋白很可能是与β2结合的,为进一步研究IFNα在治疗HBV感染和慢性肝炎中的作用机制,以及HPRE抑制性结合蛋白的作用提供了一定的实验依据。     

含人组织型纤溶酶原激活剂cDNA重组逆转录病毒的制备及鉴定

将人组织型纤溶酶原激活剂ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体ＬＮＳＸ重组后转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，形成完整的重组病毒颗粒，电镜下重组病毒呈散在分布，球形，直径９０～１８０ｎｍ，由囊膜、外壳和核心三部分组成。重组病毒颗粒感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，在含Ｇ４１８培养基中筛选培养２周后计数阳性细胞克隆数，结果达６×１０８ＣＦＵ／Ｌ；被感染的受体细胞ＮＩＨ３Ｔ３高效表达具有纤溶活性的重组人组织型纤溶酶原激活剂。     

磁转联合脂质体实现高效细胞转染

目的优化体外培养细胞的外源基因转染方案。方法采用磁性微粒联合脂质体，将重组人绿色荧光蛋白表达载体（pAAV-IRES-GFP）外源DNA定向转染COS-7细胞，荧光显微镜下观察外源基因的表达，比较不同转染条件及DNA载量的细胞转染效果。结果DNA与Combimag按1：1的比例混合转染可以得到很高的转染效率，过高的DNA载量使转染效率减低。结论利用磁转结合脂质体可使低剂量的DNA达到快速、简便和高水平的转染。