CCl4诱导的小鼠纤维化肝组织微小RNA差异表达谱及初步功能分析

 目的：应用微小RNA(miRNA)芯片技术研究miRNAs在四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠纤维化肝脏中的差异表达谱,并基于基因本体论（gene ontology,GO)分析及信号转导通路分析发现差异miRNAs的主要功能。方法：实验分为正常组及模型组,皮下注射 CCl4复制小鼠肝纤维化模型;应用Agilent 小鼠 miRNA 寡核苷酸基因芯片检测各组肝脏miRNA表达谱。用随机方差模型t检验筛选2组间的差异miRNAs,并预测其靶基因。对靶基因进行GO分析及信号转导通路分析发现差异miRNAs发挥的主要功能。结果：正常组与模型组间共筛选出39个差异miRNAs,其中模型组较正常组上调的23个,下调的16个。GO分析及信号转导通路分析结果提示差异miRNAs可能调控的靶基因及其参与的生物学功能包括细胞的增殖与活化、细胞凋亡、细胞周期、细胞黏附、细胞迁移、炎症反应、转化生长因子β（TGF-β）/Smads信号转导通路、Wnt受体信号转导通路、蛋白代谢过程的调控等。GO分析发现关键的上调miRNA包括mmu-miR-322、mmu-miR-15b、mmu-miR-195、mmu-miR-200b、mmu-miR-214等,关键的下调miRNA包括mmu-miR-16、mmu-miR-130a、mmu-miR-101b、mmu-miR-30a和mmu-miR-30e等。对显著性GO与显著性信号通路所属的靶基因取交集,对网络中miRNA在网络中的调控地位进行评价,结果发现关键的上调miRNAs包括mmu-miR-200b、mmu-miR-322、mmu-miR-106b、mmu-miR-23a、mmu-miR-15b等,关键的下调miRNAs包括mmu-miR-16、mmu-miR-30e、mmu-miR-30c、mmu-miR-30a、mmu-miR-130a等。结论：纤维化肝组织miRNAs表达较正常肝组织发生明显变化;肝纤维化形成的各个环节,包括细胞的增殖与活化、细胞黏附、细胞凋亡、细胞迁移与分化、物质代谢、TGF-β信号通路等都可能受miRNAs的调控。     

中医辨证治疗慢性肾脏病(CKD1-2期)前瞻性多中心临床研究

目的:研究中医辨证组方联合基础治疗与氯沙坦联合基础治疗对慢性肾脏病蛋白尿的临床疗效。方法:对92例入组患者采用前瞻性、随机、对照的研究方法,将患者分为中药组(69例),按脾肾气阴两虚、脾肾气阳两虚予中医辨证组方内服;西药组(23例)予氯沙坦50 mg/d口服。在治疗24周后,判定两组治疗前后不同时间点的24 h尿蛋白定量(24 h UP)、尿微量白蛋白/尿肌酐(MA/Cr)及肾小球滤过率(e GFR)的水平。结果:中药组在降低24 h尿蛋白定量,MA/Cr均优于西药组,中药组与西药组在治疗e GFR上疗效无明显差异。结论:中医辨证组方联合基础治疗对慢性肾脏病患者在减少尿蛋白方面显示了良好的临床疗效。     

毛蕊异黄酮上调过氧化物酶体增殖因子活化受体γ抑制大鼠肝星状细胞活化的研究

该研究观察了毛蕊异黄酮对大鼠原代肝星状细胞(HSC)增殖和活化的影响,并探讨其是否通过影响核因子过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(PPARγ)和法尼酯衍生物X受体(FXR)发挥作用.结果发现毛蕊异黄酮能抑制HSC的增殖,抑制活化标志物α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原的表达;随着HSC活化时间的延长,FXR表达逐渐降低,但毛蕊异黄酮对FXR表达没有明显影响;毛蕊异黄酮可浓度依赖性地上调PPARγ的表达及核转位,PPARγ拮抗剂可阻断毛蕊异黄酮对HSC活化的抑制作用.因此,结论认为毛蕊异黄酮可抑制HSC增殖和活化,其作用不通过FXR而是与上调PPARγ信号通路有关.     

组分复方“CKJ”药物血清对大鼠原代肝星状细胞活化和转化生长因子β_1及其受体的影响

目的探讨由虫草多糖、苦杏仁苷、绞股蓝总皂苷组成的"CKJ方"药物血清对大鼠原代肝星状细胞(primary hepatic stellate cells,r HSCs)活化的影响及相关药理作用机制。方法分离并培养r HSCs,将培养4天的r HSCs分为正常组、模型组及CKJ组。模型组及CKJ组以2.5 ng/m L转化生长因子β1(TGF-β1)刺激造模24 h,正常组以不含TGF-β1的基质液(无血清的DMEM)作为对照。药物组以5%CKJ方药物血清继续孵育24 h,正常组及模型组以5%空白血清孵育24 h。采用细胞高内涵筛选技术(HCS)免疫荧光法及Western blot检测r HSCsα-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、血小板源性生长因子β受体(PDGF-βR)、TGF-β1、转化生长因子β受体1(TGF-βR1)、转化生长因子β受体2(TGF-βR2)mRNA的表达水平。结果与正常组比较,模型组r HSCsα-SMA蛋白表达及α-SMA、Col-Ⅰ、PDGF-βR、TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2 mRNA表达水平明显升高(P0.05,P0.01);与模型组比较,5%CKJ药物血清组r HSCsα-SMA蛋白表达及α-SMA、Col-Ⅰ、PDGF-βR、TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2 mRNA表达水平明显降低(P0.05,P0.01)。结论组分复方"CKJ"药物血清可降低大鼠r HSCsα-SMA的蛋白表达,其主要作用机理可能与抑制TGF-β1及其相关受体有关。     

郑平东论治紫癜性肾炎经验撷萃

紫癜性肾炎是由过敏性紫癜引起的肾脏损害,目前西医对紫癜性肾炎尚无特异性治疗方案,郑平东教授在长期临床实践中,研古而习今,博采众长,自成一家,秉承祖国医学"审因溯源,辨证施治"的原则,强调整体观念,扶正祛邪并举,行血止血兼顾,临证治疗紫癜性肾炎收效甚佳,作者有幸曾跟师临证学习,现将郑老对紫癜性肾炎的论治经验总结如下,以期对紫癜性肾炎的临床治疗有所裨益。     

祛湿化瘀方对脂肪肝大鼠肝脏基因表达谱的调节作用

目的观察祛湿化瘀方对高脂饮食诱导脂肪肝大鼠肝脏基因表达谱的干预作用及其作用机制。方法20只SD雄性大鼠采用单纯高脂饮食(88%普通饲料+2%胆固醇+10%猪油)制备脂肪肝大鼠模型。造模4周后按随机数字表法分为祛湿化瘀方组(10只)和模型组(10只),继续造模同时分别给予祛湿化瘀方汤剂(0.93 g生药/100 g体重)和蒸馏水灌胃,每日1次。同时设10只SD雄性大鼠为正常组,给予等量蒸馏水灌胃,各组均于8周末取材。采用生化法检测肝组织甘油三酯(triglyceride,TG)、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)含量及血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活性;采用HE及油红染色观察肝脏组织的病理变化;采用Affymetrix基因芯片检测肝组织基因表达,比较祛湿化瘀方组与模型组差异表达基因、分析差异基因的功能以及涉及的信号通路;并选取祛湿化瘀方组与模型组间10个差异倍数大于2的涉及糖脂代谢的差异基因进行RT-PCR验证。结果(1)与正常组比较,模型组大鼠肝组织TG、FFA含量和血清ALT、AST活性均明显升高(P0.01);与模型组比较,祛湿化瘀方组大鼠TG、FFA含量和ALT、AST活性均明显降低(P0.05,P0.01)。祛湿化瘀方能降低高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝模型的肝细胞脂肪变性程度,减少炎症,改善肝组织病理。(2)祛湿化瘀方组与模型组比较,P0.05且差异倍数大于2的功能明确、有指定基因名称的差异基因共80个,其中上调基因44个,下调基因36个。80个差异基因涉及27条差异有统计学意义的信号通路(包括甘油酯类代谢、通路脂肪细胞信号通路、胰岛素信号通路及药物代谢信号通路等,P0.05)。(3)对甘油激酶(Gk)、硬脂酰CoA去饱和酶-1(Scd1)、甘油-3-磷酸转移酶(Gpat2)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)、Irs1等10个调节糖脂代谢基因的RT-PCR验证实验结果显示:所有基因RT-PCR与基因芯片结果上调或下调趋势完全一致,80%基因差异倍数非常接近。结论祛湿化瘀方可调节高脂饮食诱导的脂肪肝大鼠脂肪代谢、糖类代谢、抗脂质过氧化及药物代谢等相关基因表达,表现出中药复方的综合药理作用。     

扶正化瘀方及其治法拆方对肝损伤小鼠肝细胞凋亡的干预作用

目的：观察扶正化瘀方治法拆方对小鼠肝细胞凋亡的影响,并探讨扶正化瘀方影响肝细胞凋亡的治法特点与作用机制。方法：BABL/c雄性小鼠50只,随机分为正常组、模型组、扶正化瘀方组、扶正拆方组和化瘀拆方组,每组各10只。采用脂多糖（10μg/kg）联合半乳糖胺（900mg/kg）腹腔注射诱导急性肝损伤。各用药组小鼠于造模前3d开始分别给予扶正化瘀方、扶正拆方和化瘀拆方灌胃,每日2次,连续3d,第4日灌胃后1h开始造模;正常组与模型组小鼠给予等量生理盐水灌胃。采用比色法检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）、超氧化物歧化酶（super-oxide dimutase,SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量;苏木精-伊红染色观察肝组织炎症病理改变;原位末端标记法观察肝组织肝细胞凋亡情况;荧光定量实时聚合酶链式反应法检测肝组织肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）mRNA表达;蛋白印迹法检测肿瘤坏死因子Ⅰ型受体（tumor necrosis factor receptor typeⅠ,TNFR1）蛋白表达。结果：与模型组比较,扶正化瘀方及其拆方药物扶正拆方、化瘀拆方均可显著降低模型小鼠血清ALT和AST活性,改善肝组织炎症,减轻肝细胞凋亡,改善肝组织过氧化指标SOD活性和MDA含量,其中全方作用最好,扶正拆方优于化瘀拆方。与正常组比较,模型组肝组织TNF-αmRNA表达显著升高,扶正化瘀方及扶正拆方、化瘀拆方可显著降低其表达,其中全方作用最好,两拆方组相比差异无统计学意义。与正常组比较,模型组肝组织TNFR1蛋白表达显著升高,全方可显著降低其表达,而两拆方无明显作用。结论：扶正化瘀方和其治法拆方中扶正方可抑制小鼠肝细胞凋亡,扶正化瘀方抗肝细胞凋亡作用机制可能在于减轻肝脏脂质过氧化损伤和下调TNF-α及TNFR1的表达     

乙型肝炎后肝硬化患者中医证候要素的生物化学特征

目的：分析乙型肝炎后肝硬化患者常见症状和体征与生化指标之间的关系,揭示乙型肝炎后肝硬化的中医证候本质。方法：纳入2002年1月～2006年1月上海市公共卫生临床中心以及上海中医药大学附属曙光医院、龙华医院和普陀区中心医院的440例乙型肝炎后肝硬化患者,采用自制中医四诊信息调查表采集患者症状、体征及实验室检查指标（包括肝功能、肾功能、血脂、甲胎蛋白和B超等）。按出现频次高（〉40%）的中医症状或体征的有、无逐一将患者分为两组,分析两组间各症状、体征的实验室检查指标变化,以探寻乙型肝炎后肝硬化中医常见证候的分类特征及生物化学特点。结果：440例乙型肝炎后肝硬化患者出现频率大于40%的最常见症状和体征有乏力、尿黄、肝掌、面色晦黯、脉弦、腰膝酸软、口干口苦、多梦寐差、肢体困重、脘腹胀满、目黄、脉细、急躁易怒、脾大、纳谷不馨和胁肋疼痛。基于课题组前期对900例肝硬化患者进行证候分析的结果,440例患者的证候主要概括为湿热内蕴、肝肾阴虚、瘀热内蕴和肝郁脾虚4证。其生化特点显示,湿热内蕴证表现为肝脏的炎症活动明显,合成功能差;肝肾阴虚证则表现为肝脏炎症活动不明显,合成功能差;瘀热内蕴证表现为肝脏炎症活动不明显,但肝脏合成功能差,脾厚度增加;湿热内蕴、肝肾阴虚、瘀热内蕴同时伴有腹水增多。肝郁脾虚证也表现为以肝脏的炎症活动为主,但疾病严重程度较湿热内蕴证为轻,可伴有合成功能下降,同时腹水量少,门静脉内径小。结论：乙型肝炎后肝硬化的不同证型具有不同的病理特点,表明中医证候分类是有一定的生物学基础的。     

不同证型非酒精性脂肪性肝病患者的血清胆汁酸谱特征研究

目的：在血清胆汁酸谱层面探究非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者中医证型肝胆湿热证、肝郁脾虚证的物质基础。方法：182例NAFLD患者辨证分为无证可辨（36例）、肝胆湿热（92例）和肝郁脾虚（54例）3组;收集受试者各项指标及血清总胆汁酸（TBA）水平;通过液相色谱/串联质谱分析15种血清胆汁酸水平;比较NAFLD各证型间代谢相关指标及胆汁酸谱特征。结果：肝胆湿热组的TBA显著高于无证可辨组、牛磺石胆酸（TLCA）显著低于无证可辨组（P<0.05）;肝郁脾虚组的TBA、石胆酸（LCA）、甘氨石胆酸（GLCA）均显著高于无证可辨组（P<0.05,P<0.01）;肝郁脾虚组的甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）显著高于肝胆湿热组（P<0.05）。结论：肝郁脾虚证的NAFLD患者表现出相对更加紊乱的血清胆汁酸代谢异常,血清胆汁酸的代谢紊乱是NAFLD不同证型的物质基础之一。     

从“玄府”理论探讨风药辨治糖尿病肾病蛋白尿

现代医学认为糖尿病肾病蛋白尿与糖尿病微血管病变所致肾小球滤过膜损伤、蛋白质通透性增加有关，由历代医家对“玄府”的概念及其生理功能的阐释可知，肾“玄府”的开阖功能在微观层面与肾小球滤过膜的通透性及肾小管上皮细胞的重吸收及排泌作用存在某种契合之处，故文章从“玄府”气液说与糖尿病肾病蛋白尿之间的关联、风邪客于“玄府”辨证糖尿病肾病蛋白尿及风药宣通“玄府”治疗糖尿病肾病蛋白尿三方面，结合临床案例，探讨风药辨治糖尿病肾病蛋白尿的理论依据及临床价值，冀期对糖尿病肾病蛋白尿中医药治疗思路有所裨益。