梅毒螺旋体溶血素生物信息学分析

目的本研究旨在对梅毒螺旋体(Tp)的5种溶血素进行进一步的生物信息学分析,为后续研究溶血素家族蛋白在Tp致病过程中的致病机制提供依据。 方法通过使用NCBI、BLAST、CDD、BioEdit、ExPASy、SignalP、TMHMM、MEGA、PSORTb 3.0、ABCpred等生物信息学分析方法分析梅毒螺旋体溶血素家族蛋白的一般性质、信号肽、糖基化、磷酸化位点、亚细胞位置、二级结构、功能结构域及抗原表位。 结果预测了Tp中5个溶血素家族蛋白一般性质,Tp1037功能结构域不同于其余4种,Tp0028含有1个信号肽,Tp0027含有1个糖基化位点,Tp0027和Tp1037有多个跨膜结构域,5个溶血素家族蛋白均含有多个磷酸化位点和B细胞、T细胞表位。 结论Tp含有5个溶血素家族蛋白基因,提示Tp入侵宿主时这些基因产物极有可能通过其膜成孔毒性损伤靶细胞,从而致病。     

PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的研究

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素C的快速敏感PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌肠毒素C基因编码序列,设计1对PCR引物来特异性扩增靶基因片段,片段长度为600 bp,通过对1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株和5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株进行检测来评价该方法的特异性;对金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株做一系列10倍稀释后进行PCR检测,并对其进行敏感性分析,对PCR扩增产物进行电泳和测序鉴定。结果1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应呈阳性,5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应为阴性;通过基因测序证实了PCR产物的特异性;PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的检测下限为1.5×10^2cfu/ml。结论本研究建立了一个快速、特异、敏感的金黄色葡萄球菌肠毒素C基因PCR检测方法。     

白介素2与梅毒螺旋体膜蛋白Gpd双价核酸疫苗的免疫活性及保护作用研究

目的 探讨白介素2(IL-2)基因与梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)Gpd抗原编码基因融合构建双价核酸疫苗免疫新西兰兔后的免疫应答效果及感染Tp后的保护作用.方法 定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2,与先期构建的pcDNA3.1(+)/Gpd真核表达重组体分别设为两个疫苗实验组,同时设pcDNA3.1(+)空质粒对照组及PBS对照组,共4组,每组18只雄性新西兰兔,肌肉多点注射初次免疫,于初次免疫后第10周各实验组兔皮下接种Tp标准株进行感染实验,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同时间点免疫兔特异性抗体产生水平和脾细胞IL-2及干扰素γ(IFN-γ)诱导水平,噻唑蓝法检测兔脾淋巴细胞增殖水平.结果 用pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2融合双价疫苗和pcDNA3.1(+)/Gpd单基因疫苗在免疫期间和感染期间均能检测到高滴度的IgG特异性抗体,最高滴度分别可达1∶4096和1∶1024(P值均＜0.01);两疫苗组之间在免疫及感染期间不同时间点比较差异也有统计学意义(P值均＜ 0.01);免疫后第8周双价融合核酸疫苗组及单基因核酸疫苗组兔脾细胞培养上清中IFN-γ分别为(447±22.4)μg/L、(225±17.6)μg/L,IL-2分别为(167±15.7)μg/L、(110±12.6)μg/L,均高于空质粒对照组和空白对照组(P值均＜ 0.01);感染期间不同时间点兔脾细胞受相应蛋白刺激均有明显增殖反应,检测指标均显著高于空质粒对照组和空白对照组(P值均＜ 0.01).早期感染皮损观察显示双价融合核酸疫苗组较之单基因疫苗组有着更低的皮损Tp检测阳性率(17.5％)、溃疡病灶发生率(15％)以及更短的皮损愈合时间.结论 用pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2双基因融合疫苗在兔体内能更有效地诱导保护性体液免疫和细胞免疫应答.     

感染依赖性抗原Tp0470的鉴定及在梅毒诊断中的应用

为筛选新型梅毒诊断抗原,以改进梅毒早期诊断及预后判断血清学诊断方法,本研究在鉴定Tp0470蛋白为感染依赖性抗原的基础上,建立基于Tp0470的ELISA方法,检测468份临床血清标本,并与TPPA、LZ-ELISA及RPR结果比较,初步评价该蛋白的诊断价值;同时对Tp0470-ELISA A₄₅₀值与RPR滴度进行相关性分析。结果显示:Tp0470-ELISA的灵敏度和特异度分别为95.32%和95.66%,ROC分析其AUC值为0.907。与TPPA、LZ-ELISA及RPR结果相比,Tp0470-ELISA的符合率分别为95.51%(kappa=0.907)、94.87%(kappa=0.897)、88.67%(kappa=0.771)。Tp0470-ELISA的A₄₅₀值与RPR滴度的相关系数为0.38,P=0.96。以上结果表明基于Tp0470蛋白的ELISA在梅毒血清学诊断中具有较高的潜在应用价值。     

肺炎嗜衣原体Cpn0425重组蛋白的克隆与表达及抗原性研究

目的构建重组质粒pGEX6p-2/Cpn0425,在E.coli BL21中进行诱导表达,纯化获得重组融合蛋白Cpn0425,并评价其抗原性。方法 PCR扩增肺炎嗜衣原体Cpn0425蛋白编码基因,构建pGEX6p-2/Cpn0425重组质粒,测序正确后在E.coli BL21中诱导表达,用SDS-PAGE和Western-Blot进行分析和鉴定。结果构建了重组质粒pGEX6p-2/Cpn0425,并在E.coli BL21菌中高效表达出Mr约为50kDa的GST-Cpn0425目的蛋白,超声裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白在菌体细胞内以可溶性形式表达,经采用默克Novagen的GST纯化树脂纯化获得纯度在95%以上的重组蛋白。结论获得了Cpn0425基因片段,并在E.coli BL21中成功表达,GST-Cpn0425具有良好的抗原性。     

梅毒螺旋体体内诱生抗原Tp0462的表达鉴定及在临床血清学诊断中的应用评价

目的 筛选鉴定并评价梅毒螺旋体（Tp）体内诱生抗原Tp0462的临床血清学诊断价值。方法 提取Tp Nichols株全基因组,PCR扩增Tp0462,克隆构建重组质粒pET30a（+）?Tp0462,转化至E.coli Rosetta（DE3）菌,大量诱导表达重组蛋白Tp0462并纯化、鉴定。18只新西兰兔随机平均分为活Tp接种组、紫外线照射灭活Tp接种组和未接种对照组,接种后不同时间点抽血分离血清,用ELISA鉴定Tp0462蛋白的体内诱生性特点。ELISA法（Tp0462?ELISA）、梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）、梅毒初筛ELISA试验及快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）试验检测336份临床梅毒患者血清样本,初步评价该蛋白的诊断价值。结果 重组质粒Tp0462?pET30a（+）在E.coli Rosetta（DE3）中最适的表达条件为0.5 mmol/L IPTG,20 ℃,180 rpm摇床诱导培养4 h。活Tp接种组血清Tp0462特异性抗体水平从第2周起呈急剧上升趋势,至5周后趋于平稳,而灭活Tp接种组及未接种对照组血清Tp0462特异性抗体水平一直处于低水平。活Tp接种组Tp0462特异性抗体水平显著高于灭活Tp接种组及未处理组（P < 0.05）,而灭活Tp接种组与未处理组相比,差异无统计学意义（P = 0.256）。活Tp接种组、灭活Tp接种组Tp92抗体水平显著高于未处理组（P < 0.05）,而活Tp接种组与灭活Tp接种组差异无统计学意义（P = 0.127）。与TPPA相比,Tp0462?ELISA的灵敏度和特异度分别为91.7%和98.8%,符合率为95.2%,曲线下面积为0.997。Tp0462?ELISA与梅毒初筛ELISA试验的符合率为92.3%,Kappa值为0.846;与RPR试剂盒的符合率为83.9%,Kappa值为0.293。结论 Tp0462在梅毒血清学诊断中具有较高的灵敏度和特异度,可以作为潜在的梅毒诊断候选蛋白。     

乳腺炎奶牛双重感染抗热分枝杆菌和象分枝杆菌的鉴定及药敏试验研究

目的 对疑似分枝杆菌感染乳腺炎奶牛进行病原及药敏谱调查。方法 采集1头患乳腺炎奶牛的牛奶,采用4% NaOH预处理,接种于L-J培养基分离培养。阳性培养物利用抗酸染色和多位点PCR方法进行初步鉴定,采用16S rRNA、hsp65、ITS,和SodA基因的多位点序列分析进行种的鉴定,利用Alamar blue显色法对分离菌株进行27种药物的药敏试验。结果 从1头患乳腺炎奶牛的牛奶中同时分离获得2株抗酸染色阳性培养物,经PCR鉴定为非结核分枝杆菌,多位点序列分析鉴定为抗热分枝杆菌和象分枝杆菌。药敏试验表明这2株菌对利福平和异烟肼等大多数抗结核药物耐药,但对阿米卡星、莫西沙星、左氧氟沙星、乙胺丁醇、链霉素、妥布霉素、环丙沙星和利奈唑胺等敏感。结论 乳腺炎奶牛中分离了抗热分枝杆菌和象分枝杆菌,有其独特的药敏谱特征,为其感染防治提供了科学依据。     

自噬与固有免疫应答相互调节研究进展

自噬在细胞分化、肿瘤、炎症、免疫等多方面发挥关键作用.近年来,随着分子生物学、细胞生物学、免疫学等学科的发展,研究发现细胞自噬与固有免疫应答有着重要的相互调控作用.自噬是固有免疫的重要组成成分,可以通过溶酶体直接降解被自噬体包裹的病原体.自噬参与众多固有免疫信号的调控.固有免疫信号也诱导或抑制自噬.自噬在抗胞内病原体感染中发挥重要作用.     

Cpn0425重组蛋白诱导细胞凋亡和产生前炎症因子的研究

目的研究Cpn0425重组蛋白在体外诱导人单核细胞产生前炎症细胞因子IL-8和IL-1β的水平及诱导细胞凋亡的作用,为进一步探索Cpn感染致病的分子机制提供试验依据。方法 PCR扩增肺炎嗜衣原体Cpn0425蛋白编码基因,构建pGEX6p-2/Cpn0425重组质粒,在E.coli BL21中诱导表达,超声裂解后用谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）纯化树脂纯化重组蛋白,ToxinEraser纯化柱去除内毒素后用不同浓度的GST-Cpn0425刺激THP-1细胞;ELISA法检测经刺激后的THP-1细胞产生的IL-8和IL-1β水平;以WST-1法检测经GST-Cpn0425处理后THP-1细胞的增生或抑制作用;用AnnexinV-FITC-PI染色法检测细胞凋亡情况。结果GST-Cpn0425能诱导THP-1细胞表达IL-8和IL-1β,当浓度增加到6μg/m（l8μg/ml）时,所产生的IL-8和IL-1β量最大,浓度分别为（716.11±41.26）pg/ml和（32.91±5.49）pg/ml。当6μg/ml GST-Cpn0425分别刺激细胞6h后即可从培养基中检测到IL-8和IL-1β,而刺激24h产生的量则达到高峰。GST-Cpn0425以剂量依赖方式抑制THP-1细胞增殖;GST-Cpn0425处理THP-1细胞24h后能诱导其发生凋亡,其细胞凋亡率最高为（17.76±4.2）%。结论Cpn0425蛋白能诱导THP-1细胞表达并分泌前炎症细胞因子IL-8和IL-1β;既能抑制THP-1细胞增殖,又能诱导其凋亡;因而可能是一个重要的致病因素。     

幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20的表达纯化及其临床应用的初步研究

目的获得重组幽门螺杆菌（H．pylori）脂蛋白（rLpp20）,并研究其在血清学诊断中的应用价值。方法应用重组质粒pGEX-6P．2／Lpp20在大肠杆菌（E．coli）BL21中表达,并进行GST亲和层析纯化,用Western．blot检测纯化产物（rLpp20）的免疫反应性;以rLpp20为包被抗原建立ELISA法对200份患者血清标本进行特异性IgG抗体检测,并与幽门螺杆菌-IgG抗体检测试剂盒法进行比较。结果成功表达的rLpp20（43000Mr）,纯化产物可被幽门螺杆菌多克隆抗体及阳性血清识别;成功建立了以rLpp20为包被抗原的间接ELISA法,其灵敏度为91．0％,特异度为100％。与试剂盒法比较,两者的符合率为95．5％。结论Lpp20具有良好的免疫反应性,能与幽门螺杆菌阳性血清特异性结合,有望应用于幽门螺杆菌血清学诊断。