问号钩端螺旋体T和B细胞表位联合基因的原核表达及其产物免疫性分析

目的 构建问号钩端螺旋体(简称钩体)LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T-和B-细胞联合表位融合基因及其原核表达系统,并对表达产物的免疫原性进行鉴定.方法 人工合成多表位联合基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测重组蛋白;采用MAT检测重组蛋白兔抗血清与我国钩体标准参考株的凝集效价;Western blot和ELISA检测重组蛋白的免疫原性.结果 获得了多表位融合基因并构建了原核表达系统.表达产物的相对分子质量约为23×103,且主要以可溶性形式存在;重组蛋白兔抗血清免疫双扩散效价为1∶8,该抗血清能与我国15群的钩体标准参考株发生凝集反应,ELISA证明该重组蛋白能检测不同群型钩体感染患者血清中的抗钩体抗体.结论 成功构建了包含钩体LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T和B细胞联合表位基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及血清学检测的抗原.     

189株嗜麦芽寡养单胞菌耐药性检测与氨基糖苷类修饰基因的分布

目的调查嗜麦芽寡养单胞菌对常用抗菌药物的耐药率及氨基糖苷类修饰基因的分布状况。方法采用琼脂扩散试验法,对临床分离的189株嗜麦芽寡养单胞菌的耐药性进行了检测;以PCR法检测189株嗜麦芽寡养单胞菌氨基糖苷类修饰酶基因。结果临床分离的189株嗜麦芽寡养单胞菌对亚胺培南和阿米卡星的耐药率分别为19.05%和23.81%;其中,aac(3)-Ⅰ检测到23株、aac(3)-Ⅱ检测到45株、aac(6)-Ⅰb检测到13株、aac(6)-Ⅱ检测到9株,分别占12.17%、23.81%、6.88%、4.76%。结论嗜麦芽寡养单胞菌对临床常用抗菌药物耐药性已非常严重,存在大量耐药基因。     

耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因序列研究

目的研究杭州地区结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)对利福平(RFP)的耐受与rpoB基因突变的关系.方法随机挑选了90例结核杆菌感染的病例,选择了利福平作为主要的药物进行药敏实验,PCR扩增39株耐RFP结核分支杆菌的rpoB基因片段(580bp);测定扩增片段的序列,并与美国国立生物信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)检索获得结核杆菌野生株(利福平敏感株)序列(登陆号:AJ749948)作对比分析.结果结果显示PCR结核测序方法得到了39例结核杆菌耐药株,51例敏感株,与药敏实验的方法检测的结果完全一致.测定的11株临床分离的耐药株中,526位或531位有突变,其中526位有突变的有7株,占耐药测定株63.6%,531位突变的有4株,占耐药测定株36.4%,未见两位点同时突变.检测的11株敏感株,未见526位或531位有突变.结论杭州地区结核分支杆菌耐利福平的发生与rpoB基因的526位或531位突变密切相关,与国外的报告基本相似.但526位突变占耐药测定株高达63.6%,如此高比例目前国内外未见相似报道.PCR扩增和产物测序将是临床检测结核分支杆菌耐利福平和耐多药的一种迅速、准确的方法.     

葡萄糖对尿液白细胞干化学法测定的影响

尿常规是检验科三大常规检查之一，其检测的准确性对于疾病的临床诊断和治疗具有重要的临床意义。本研究通过对我院干化学法测定尿液白细胞情况进行观察和分析，现报告如下。     

结核分枝杆菌rPstS1-HspX融合蛋白的表达、纯化及其免疫反应性分析

目的 构建结核分枝杆菌rPstS1-hspX (rph)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+)-rPstS1-hspX[pET-23b(+)-rph],表达、纯化rPstS1-HspX (rPH)融合蛋白,并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将PstS1和HspX编码基因通过多肽接头(GSGSG)的DNA序列进行连接,构建融合基因rph.将融合基因定向克隆入原核表达载体pET-23b(+),构建重组原核表达质粒pET-23b(+)-rph.将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3) pLysE感受态细胞,IPTG诱导融合蛋白表达.SDS-PAGE和Western印迹法鉴定其表达情况.用镍离子鳌合亲和层析柱纯化融合蛋白,Western印迹法初步评价融合蛋白的免疫反应性.结果 融合基因rph及其原核表达载体pET-23b (+)-rph构建成功.融合蛋白rPH主要以可溶性非包涵体形式表达,相对分子质量为51 000,表达量约占菌体总蛋白的23％.经亲和层析后得到了纯度达92％的融合蛋白.Western印迹证实融合蛋白能与结核病阳性血清发生特异性免疫反应.结论 成功构建了原核表达载体pET-23b(+)-rph,获得了rPH融合蛋白,为rPH融合蛋白在结核病诊断中的应用提供了依据.     

应用pcr-sscp技术检测结核分枝杆菌耐链霉素相关基因rpsl和rrs突变

目的 应用聚合酶链反应-单链构象多态性(pcr-sscp)技术,建立快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药相关基因rpsl和rrs突变的新方法.方法 采用常规药敏试验检测112株结核分枝杆菌临床分离株对链霉素的耐药性,建立pcr-sscp法检测耐药相关基因rpsl和rrs的突变.采用pcr直接测序技术(pcr-ds)确定rpsl和rrs基因突变情况并与pcr-sscp法检测结果进行比较.结果 112株结核分枝杆菌临床分离株均携带rpsl和rrs基因,52株(46.4％)对链霉素敏感,其中有1株敏感菌株rrs基因pcr-sscp条带异常,pcr-sscp方法的特异性为98.1％ (51/52).60株(53.6％)结核分枝杆菌对链霉素耐药,用pcr-sscp方法分别检出46株(76.6％) rpsl基因和11株(18.3％)rrs基因条带异常,1株同时出现rpsl和rrs基因条带异常,pcr-sscp检测的灵敏度为93.3％ (56/60).结论 pcr-sscp方法检测结核分枝杆菌耐药相关基因rpsl和rrs突变的特异性和敏感性高,临床上值得推广应用. abstract： objective to establish a novel rapid detection method based on pcr-single-strand-conformational polymorphism (pcr-sscp) to determine mutation of streptomycin-resistance associated rpsl and rrs genes in isolates of mycobacterium tuberculosis (mtb).methods streptomycin-resistance of 112 mtb isolates was detected using the routine drug susceptibility test,and a special pcr-sscp assay was established.the mutations of rpsl and rrs genes in streptomycin-resistant mtb isolates were detected by pcr-sscp and pcr direct sequencing (pcr-ds) ; the results from two techniques were compared.results all isolates had both rpsl and rrs genes.fifty-two isolates (46.4％) were streptomycin susceptible,in which only 1 isolate showed abnormal pcr-sscp fragments from rrs gene,and the specificity of pcr-sscp was 98.1％ (51/52).sixty isolates (53.6％) were streptomycin-resistant,in which 46 (76.6％) and 11 ( 18.3％ ) isolates presented the abnormal pcr-sscp fragments of rpsl and rrs gene,respectively.one streptomycin-resistant isolate showed abnormal pcr-sscp fragments from both rpsl and rrs genes.the sensitivity of pcr-sscp was 93.3％ (56/60).conclusion the pcr-sscp that established in this study is a specific and sensitive method for rapid detection of the streptomycin-resistance associated mutations in rpsl and rrs genes of mtb.     

支气管肺泡灌洗液中检出卡氏肺孢子虫2例

1临床资料病例1:患者,男,59岁,因"发热1月,胸闷气促1周"以"发热,双肺弥漫性病变"收入院。患者入院前1月出现发热,多为午后升高,最高达38.5℃,无畏寒,咳少许白色泡沫样痰,当地给予抗感染、化痰治疗效果欠佳。入院前1周出现活动后胸闷、气促,胸部CT示两肺弥漫性间质性炎症。入院体检:T36.7℃,P 84bpm,R 22bpm,BP 105/74mmHg。桶状胸,双肺呼吸音粗。两肺可闻及细湿啰音。心腹部查体无明显异常,双下肢无浮肿。实验室检查:     

结核分枝杆菌rPstS1-HspX融合蛋白的制备及其血清学诊断价值

目的表达、纯化结核分枝杆菌rPstS1-HspX（rPH）融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法异丙基．陆D一硫代吡喃半乳糖苷（帆）诱导rPH融合蛋白表达,并用镍离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白。Western印迹分析纯化后融合蛋白的免疫反应性。最后用ELISA法检测194份血清抗体样本,其中来源于肺结核患者94份,非结核肺部疾病患者52份,健康对照者48份。结果rPH融合蛋白在大肠埃希菌中主要以可溶性非包涵体形式表达,相对分子质量为51000。经亲和层析后得到了浓度为0．62ng／mL,纯度达92％的融合蛋白。Western印迹实验证实纯化后融合蛋白能与结核病阳性血清发生特异性免疫应答。重组蛋白rPH血清检测的灵敏度为77．6％（73／94）,特异性为92．0％（92／100）。结论成功表达和纯化了rPH融合蛋白,其用于结核病血清学诊断具有较好的灵敏度和较高的特异性,是ELISA的可靠抗原。     

清肺合剂对晚期非小细胞肺癌化疗患者免疫功能的影响

目的:观察清肺合剂对晚期非小细胞肺癌化疗患者免疫功能的的影响。方法:纳入82例晚期非小细胞肺癌患者,随机分为观察组和对照组各41例。对照组采取常规剂量化疗,观察组在化疗基础上予清肺合剂连续治疗8周。观察2组患者治疗前后T淋巴细胞亚群(CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD4~+/CD8~+)、自然杀伤细胞(NK)、血清免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)等指标的变化,采用CT评价实体肿瘤大小。结果:治疗后,观察组实体瘤疗效总有效率为68.29%,高于对照组的43.90%,差异有统计学意义(P0.05)。对照组CD8~+水平较治疗前下降(P0.05),其他指标与治疗前比较均无统计学差异(P0.05);观察组NK、CD3~+、CD4~+和CD4~+/CD8~+均较治疗前升高(P0.05),并高于对照组(P0.05),CD8~+水平较治疗前下降(P0.05),并低于对照组(P0.05)。观察组IgG、IgA、IgM水平较治疗前升高(P0.05),并高于对照组(P0.05)。结论:在化疗的同时采用清肺合剂治疗晚期热毒炽盛型非小细胞肺癌患者,可改善患者的免疫功能,提高治疗效果。     

苯作业工人淋巴细胞p53相关基因mRNA表达水平分析

目的 了解苯环境作业工人外周血淋巴细胞中,经p53介导的DNA损伤修复路径相关基因表达水平.方法 选择某喷涂厂直接接苯工人46人(直接接苯组)、间接接苯工人26人(间接接苯组)和无苯及其他毒物接触工人29人(对照组),应用SYBR GreenI嵌合荧光法实时RT-PCR分析技术,检测外周血淋巴细胞p53及相关基因mRNA表达水平,比较对照组与作业组问P53及相关基因mRNA表达倍数差异.结果 直接接苯组和间接接苯组p53、Ku80、Ape1和Mdm-2 mRNA表达水平与对照组比较磋异无统计学意义(P＞0.05);p21有增高趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05).直接接苯组的Rad51、Bcl-2、Bax、Xpa和Xpc mRNA表达水平下调、间接接苯组Rad51 mRNA表达下调,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).直接接苯组的白细胞、血红蛋白和血小板分别为(4.93±1.27)×10- /L、(123.97+11.80)g/L和(124.02±41.22)×109 /L,间接接苯组血小板为(135.80±39.44)×109 /L,均低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 长期慢性的低浓度苯接触可使工人淋巴细胞中p53介导的部分DNA损伤修复相关基因mRNA表达水平发生改变,直接接苯工人的外周血白细胞、血红蛋白、血小板减低以及Bcl-2、Bax、Xpa和Xpc mRNA表达水平改变明显.