分离外周血单个核细胞的条件优化

目的比较不同抗凝剂、离心力及离心时间对葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度离心法分离单个核细胞的影响,优化实验方案。方法取肝素、EDTA及2种抗凝剂混合后的3种不同抗凝血,采用Ficoll法进行分离,用血细胞分析仪进行分类和计数,计算回收率和纯度;同时对EDTA抗凝血进行不同离心力及离心时间的处理,优化分离效果。结果 EDTA组获得PBMC回收率为(51.32±50.21)%,纯度为(45.38±22.14)%;肝素组获得PBMC回收率为(24.52±19.10)%,纯度为(78.46±11.91)%;EDTA+肝素组获得PBMC回收率为(56.32±24.30)%,纯度为(80.27±12.44)%。经单因素方差分析,PBMC回收率方面,EDTA组与肝素组比较差异有统计学意义(P0.05),EDTA组回收率较高,而肝素+EDTA组与EDTA组回收率比较,差异无统计学意义(P0.05);PBMC纯度方面,EDTA组与肝素组比较差异有统计学意义(P0.05),肝素组PBMC纯度较高,而肝素+EDTA组与肝素组比较,纯度则差异无统计学意义(P0.05);PBMC存活率方面,肝素+EDTA组与肝素组、EDTA组比较,均差异无统计学意义(P0.05)。对EDTA抗凝血进行单个核细胞分离实验表明,在离心力为600×g(1 800r/min),离心时间为25min时分离效果最佳。结论肝素+EDTA组回收率、纯度与单种抗凝剂实验组相比,结果差异无统计学意义(P0.05),故在实验过程中可以混合两种抗凝全血进行细胞分离。EDTA抗凝血在离心力为600g(1 800r/min)、离心时间为25min时,分离单个核细胞效果最佳。     

嗜麦芽窄食单胞菌产氨基糖苷类修饰酶基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ的克隆与表达

目的对嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株gzch810(SM gzch810)携带的产氨基糖苷类修饰酶基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ进行扩增、测序及原核表达,为下一步功能试验的开展提供基础材料。方法提取SM gzch810基因组染色体,PCR扩增APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ全基因并克隆入pMD18-T载体进行核苷酸序列分析;将APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况。结果以染色体DNA为模板,成功扩增800bp APH(3′′)-Ⅰ基因和550bp AAC(2′)-Ⅰ基因;序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性分别达91%及95%;SM gzch810APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ序列已登录GenBank(登录号:HQ315852和HQ315853);SDS-PAGE显示,融合基因表达的蛋白相对分子质量分别约为56×103和46×103。结论从SM gzch810中成功克隆及表达了APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因,为下一步检测上述两种重组体大肠杆菌对相应抗菌药物的耐药性及其功能评价做好准备。     

儿童耐亚胺培南铜绿假单胞菌的感染现状及药敏分析

目的调查本院2012年10月至2013年9月患病儿童送检标本中分离出铜绿假单胞菌的感染状况以及亚胺培南耐药株的药敏分析。掌握广州地区儿童感染铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药状况及耐亚胺培南菌株的发生情况。方法分析2012年10月至2013年9月儿童送检感染标本的铜绿假单胞菌检出情况,采用法国生物梅里埃公司的VITEK 2Compact分析仪进行细菌鉴定,检测对亚胺培南耐药铜绿假单胞菌对11种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。结果从36 600例标本中共检出161株铜绿假单胞菌,其中耐亚胺培南铜绿假单胞菌24株占14.9%;阳性菌株主要来源于痰标本,高达50.3%,分离最高的是ICU和NICU,分别占27.4%和21.8%。耐亚胺培南铜绿假单胞菌对头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、氨曲南的耐药率比较高,分别是91.7%、29.0%、29.0%、29.0%和25.0%。结论耐亚胺培南的铜绿假单胞菌在本地区儿童中检出率较高,常对其他抗菌药物多重耐药,应引起高度重视,合理使用抗菌药物。     

正常妊娠妇女不同孕期凝血指标变化及其临床意义探讨

目的观察正常妊娠妇女不同孕期的凝血指标变化并探讨其临床意义。方法使用法国STAGO Compact全自动血凝仪,分别在孕中、孕晚及临产期测定207例正常妊娠妇女的凝血酶原时间(PT)、国际标准化比值(INR)、活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)及纤维蛋白原(FIB),以205例同期健康体检的育龄期妇女为对照,比较其各项凝血指标的变化情况。结果正常妊娠组与非孕对照组相比,APTT、PT、INR、TT明显缩短,FIB水平明显升高;孕晚期APTT、PT和INR较孕中期和临产期明显缩短;临产期TT较孕中期及孕晚期明显缩短,孕中、晚期差异则无统计学意义(P0.05);孕晚期、临产期FIB水平较孕中期明显升高,孕晚期、临产期比较差异则无统计学意义(P0.05)。结论正常妊娠期妇女随孕期的延长,血浆处于高凝状态。定期动态监测凝血指标,可及时了解体内凝血功能状况,对预防和治疗产中、产后异常出血及产科并发症具有重要的临床意义。     

广州地区肺炎链球菌儿童分离株临床分布及药敏特征

目的分析儿童肺炎链球菌的临床分布和耐药性,为临床合理用药提供依据。方法按全国临床检验标准操作规程对2013年1月1日至2015年12月31日间采集的儿童细菌培养标本进行常规肺炎链球菌分离培养和鉴定,结合检验历史系统分析阳性病例来源标本类型及患儿年龄分布,并用MIC法分析肺炎链球菌的耐药性情况。结果共分离1 243株肺炎链球菌,1岁以内婴儿分离率最高,占42.80%。标本来源有呼吸道标本(72.81%),耳分泌物(15.37%),血液(5.63%),脑脊液(3.06%),胸腔积液(2.01%)。所分离的肺炎链球菌株中,对红霉素、四环素、复方磺胺甲噁唑的耐药率分别高达94.93%、85.76%和73.53%,对青霉素G、阿莫西林、头孢曲松、美罗培南、头孢噻肟耐药率较高,分别为24.70%、39.59%、24.05%、22.85%,19.89%,对喹诺酮类耐药率均低于10.00%,未发现万古霉素和利奈唑胺耐药株。结论 0~1岁为广州地区儿童肺炎链球菌感染的主要年龄阶段,该地区肺炎链球菌儿童分离株对红霉素、四环素、复方磺胺甲噁唑的耐药情况较严重,青霉素G、阿莫西林、头孢曲松的耐药性有显著提高,在临床使用上应引起重视。临床医生应根据药敏试验结果合理选择抗菌药物,以提高治愈率。     

四种儿童常见肠道致病菌的多重PCR检测

目的 对儿童感染性腹泻能进行四种常见病原菌如肠致病性大肠埃希菌（enteropathogenic Escherichia coli,EPEC）、沙门菌属（Salmonella spp.）、志贺菌属(Shigella spp.)、空场弯曲菌(Campylobacter Jejuni)的快速检测。方法 建立多重PCR检测体系。结果 该方法用一次PCR即可检测四种肠道致病菌,灵敏度达10~100CFU/ml;同时利用16S rRNA基因的保守区域作为内参照,有利于对粪便标本的扩增进行质量控制;对粪便标本,整个检测过程约5 h。结论 通过检测编码细菌的毒力因子或特异性生化反应相关的酶的基因,多重PCR体系能特异、灵敏、快速地检测四种肠道致病菌;icsA基因可以作为志贺菌属检测的特异性靶基因;该方法可进一步完善成体外基因诊断试剂盒。     

儿童真菌感染的病原学研究

目的探讨广州地区儿童真菌感染的病原分布特点及其耐药状况,为防治儿童真菌感染提供实验室依据。方法对患儿感染部位的真菌进行分离培养和鉴定：以ATB^TM FUNGUS3酵母样真菌药敏试验条进行常用抗真菌药物的敏感性分析。结果从患儿标本中分离出558株真菌,主要来自呼吸道有299株,占53．58％;其次是消化道、伤口（创口）、泌尿系统和血液等,分别占28．14％、6．27％、4．66％、3．76％。其中白色假丝酵母菌367株,占65．77％;其次为热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、季也蒙假丝酵母菌等,分别占15．28％、5．02％、4．48％、3．41％、2．69％。从骨髓中检出5株马尔尼菲青霉,从脑脊液中检出3株新型隐球菌。真菌对两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等总耐药率分别为8．78％、4．84％、10．54％、1．36％、0．85％。结论引起儿童真菌感染的主要病原菌是白色假丝酵母菌。对真菌感染应该有针对性地使用高效的抗真菌药物进行早期治疗。     

广州地区1～8岁健康儿童免疫球蛋白免疫比浊法检测以及参考范围的建立

目的 建立1～8岁儿童血清免疫球蛋白含量的参考范围.方法 应用Beckman-coulter Immage800特种蛋白分析仪.采用免疫比浊法对968例1～8岁健康儿童血清免疫球蛋白含量进行检测,分成7个年龄段.并对结果进行统计分析.结果 本实验男女性各年龄阶段血清免疫球蛋白含量的参考范围存在不同程度差异,同时与全国操作规程以及与厂家提供的参考范围相比较都差别较大.结论 1～8岁儿童血清免疫球蛋白旧的参考范围已不适用于当今人群,各地、各实验室应测定一批健康人的标本,统计出本实验室的参考范围.     

1例红斑狼疮合并免疫性溶血性贫血对全血细胞分析仪干扰及处理

在工作中，我们遇到1例系统性红斑狼疮继发自身免疫性溶血性贫血患者，因红细胞有自身凝集现象干扰血细胞分析仪计数出现异常报警信息，现将病例及处理方法报道如下。     

广州地区1～8岁健康儿童免疫球蛋白免疫比浊法检测以及参考范围的建立

目的建立1～8岁儿童血清免疫球蛋白含量的参考范围。方法应用Beckman-coulter Immage 800特种蛋白分析仪,采用免疫比浊法对968例1～8岁健康儿童血清免疫球蛋白含量进行检测,分成7个年龄段,并对结果进行统计分析。结果本实验男女性各年龄阶段血清免疫球蛋白含量的参考范围存在不同程度差异,同时与全国操作规程以及与厂家提供的参考范围相比较都差别较大。结论1～8岁儿童血清免疫球蛋白旧的参考范围已不适用于当今人群,各地、各实验室应测定一批健康人的标本,统计出本实验室的参考范围。