DNA聚合酶β表达水平对苯代谢物氢醌致细胞凋亡及线粒体膜电位的影响

目的 探讨DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,polβ)对氢醌(HQ)所致细胞凋亡的影响及其可能的分子机制.方法 以polβ野生型(polβ+/+)、polβ缺陷型(polβ-/-)及polβ高表达型(polβoe)小鼠胚胎成纤维细胞为研究对象,以不同浓度的HQ溶液染毒后,采用流式细胞术分别检测HQ对细胞凋亡和线粒体膜电位( △Ψm)的影响,试剂盒法测定细胞内活性氧(ROS)和羟自由基(·OH)含量;化学发光法分析细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力.结果 与对照组相比,各染毒组凋亡细胞率和△Ψm降低的细胞比例明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞比较,20.00、40.00、80.00 μmol/L染毒组polβ-/-细胞凋亡率明显增高,10.00、20.00、40.00、80.00μmol/L染毒组polβ oe细胞凋亡率明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞(20.60％±0.57％、37.95％+0.64％、44.50％±1.27％、57.55％+1.06％)比较,10.00、20.00、40.00、80.00 μmol/L染毒组polβ-/-细胞△Ψm降低的细胞比例(33.60％±1.55％ 、46.05％±1.77％、52.75％±2.05％、75.20％±0.56％)明显增高,polβ oe细胞△Ψm降低的细胞比例(16.05％±1.20％、29.80％±1.21％、35.15％±1.06％、53.80％±0.85％)明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞比较,各染毒组polβ-/-细胞产生的荧光强度明显增高,polβ oe细胞的荧光强度明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞相比,20.00、40.00 μmol/L染毒组polβ-/-细胞内·OH含量明显增高,polβ oe细胞内·OH含量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).在相同浓度HQ染毒剂量下,polβ-/-细胞内SOD和GSH-Px消耗最快,polβ oe细胞内的SOD和GSH-Px消耗速度缓慢.结论 HQ可诱导细胞产生ROS,降低△Ψm,从而介导凋亡的发生;polβ可以帮助细胞对抗ROS的产生,降低线粒体发生去极化的几率,从而对HQ介导的凋亡起到一定的保护作用.     

氢醌对A549细胞人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶基因mRNA表达的影响

目的 观察不同浓度氢醌(hydroquinone,HQ)对人肺腺癌A549细胞活性氧(reactiveoxygen species,ROS)、脂质过氧化损伤产物丙二醛(malonaldehyde,MDA)、抗氧化酶活性以及氧化损伤修复酶人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(human 8-oxo-guanine DNA glyeoslase,hOGG1)基因mRNA表达的影响,探讨HQ毒作用的分子机制.方法 不同浓度HQ作用于A549细胞,噻唑兰(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)法测定细胞存活率,荧光探针检测细胞内ROS的变化,比色法测定MDA含量和过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力,逆转录聚合酶链反应(reverse transeription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术分析hOGG1基因mRNA的表达.结果 随着HQ浓度的增加,各实验结果为:(1)A549细胞的吸光度值(A值)下降,160 μmol/L和320 μmoL/L浓度组[(0.584±0.098)、(0.328±0.066)]与对照组(0.989±0.150)相比差异有统计学意义(q值分别为5.56、9.07,P值均<0.05),且两组细胞存活率均低于80%;(2)A549细胞内ROS生成增多,40 μmol/L和80 μmoL/L浓度组A值[(39.80±4.15)、(101.99μ9.45)]与对照组(5.71±0.50)相比差异有统计学意义(q值分别为10.74、30.32,P值均<0.05);(3)SOD、GSH-Px活性下降,活性值在80 μmol/L时[(22.93±0.56)U/mg prot、(25.60±2.31)U/mg prot]均低于对照组[(25.62±0.28)U/mg prot、(38.97±2.61)U/mg prot],差异有统计学意义(q值分别为12.17、8.78,P值均<0.05);MDA含量升高,在40 μmol/L和80 μmol/L[(1.07±0.01)nmol/mg prot、(1.19±0.08)nmol/mg plot]时高于对照组[(0.77±0.04)nmol/mg prot],差异有统计学意义(q值分别为10.90、15.49,P值均<0.05);SOD(r=-0.95,F=20.00,P=0.04)与GSH-Px(r=-0.99,F=115.48,P=0.01)活力的下降和MDA(r=0.96,F=21.31,P=0.04)含量的升高均与HQ浓度的变化具有剂量-反应关系;(4)RT-PCR结果显示:HQ作用后,A549细胞hOGG1 mRNA的表达呈下降趋势,80 μmoL/L浓度组hOGG1 mRNA的表达(0.478±0.017)与对照组(0.715±0.038)相比降低较明显(q=11.70,P<0.05).结论 HQ可以诱导细胞活性氧增加和hOGG1基因mRNA表达水平下降,提示氧化损伤是HQ毒作用的重要机制.     

乙醇染毒对果蝇寿命及某些生化指标的影响

目的探讨不同浓度乙醇对果蝇寿命以及果蝇体内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、以及丙二醛(MDA)含量的影响。方法收集8小时内羽化未交配雌雄果蝇7200只,雌雄各半。取其中2400只,随机分为6组,每组雌雄果蝇各200只,给予不同浓度乙醇染毒,每4天更换1次培养基,每天记录死亡数,用生存实验检测乙醇对果蝇寿命的影响。另取4800只,随机分为4组,每组雌雄各600只,给予含不同浓度乙醇的培养基喂养,分别于喂养0天、10天、20天和30天测定SOD和GSH-Px活力,同时检测MDA的含量。结果随着乙醇剂量的增加,雌雄果蝇的寿命均呈下降趋势,高剂量乙醇染毒组果蝇寿命显著降低(P<0.05)。在相同染毒剂量下,随着染毒时间的增加,果蝇体内SOD、GSH-Px活性逐渐降低,MDA含量逐渐升高;当染毒20天和30天时,90mmol/L、270mmol/L剂量组SOD、GSH-Px活性及MDA含量与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。结论乙醇暴露能降低果蝇寿命,并导致果蝇体内SOD和GSH-Px活力的降低和MDA含量的增高。     

围生期接触磺胺二甲嘧啶对子代大鼠海马神经营养因子家族表达的影响

目的 了解妊娠中晚期和哺乳期接触磺胺二甲嘧啶对子代大鼠海马内神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的影响.方法清洁级SD母鼠在受孕第7日起至哺乳期结束分别每日喂饲磺胺二甲嘧啶50、100和200mg/kg,取其30日龄仔鼠的大脑进行免疫组化染色,观察海马内NGF和BDNF的表达.结果 大脑的免疫组化分析发现,50、100、200mg/kg组子代大鼠海马Cal和CA3区NGF表达的积分光密度值显著低于对照组(P＜0.05),200mg/kg剂量组BDNF表达的积分光密度值显著低于对照组(P＜0.05).结论 磺胺二甲嘧啶喂饲染毒围生期母鼠,可能通过降低大鼠体内的甲状腺素浓度使脑组织NGF、BDNF表达下调,进而影响大脑的正常发育及功能.     

重组酵母测评系统检测环境雌激素的影响因素探讨

目的 :探讨重组酵母测评系统中影响 β -半乳糖苷酶活性的因素。 方法 :以乙烯雌酚为受试物 ,研究在检测环境雌激素的重组酵母测评系统中 ,振荡和非振荡培养、酵母扩增时间、受试物作用时间和裂解方式等对酶活性的影响。结果 :在非振荡培养条件下 ,可检出乙烯雌酚的雌激素活性 ,且与振荡培养条件下的雌激素活性差异无统计学意义(P >0 0 5 )。非振荡培养时 ,在 18～ 30h内 ,随酵母扩增时间的延长 ,酶活性逐渐增加 ,30h后 ,酶活性则随扩增时间的延长而逐渐降低 ;各剂量组的乙烯雌酚作用时间以 30h时酶活性最高 ,若将作用时间延长至 4 8h ,酶活性则明显下降 (P<0 0 1) ;在不同裂解方式下 ,各剂量组乙烯雌酚的酶活性大小顺序为 :液氮裂解 >Y -PER裂解 >彗星实验裂解液裂解 >SDS +氯仿 (CHCl3 )裂解 >超声破碎。结论 :重组酵母测评系统检测环境雌激素的优化组合为 :恒温培养箱中酵母扩增 2 4～ 30h ,受试物作用 30h ,Y -PER或液氮裂解酵母细胞。     

建立非放射性连接介导PCR技术检测p53基因链断裂

ＤＮＡ链断裂是一种严重的ＤＮＡ损伤。它可引起基因突变 ,ＤＮＡ重排 ,染色体结构异常乃至细胞死亡等。在常用的检测方法中 ,单细胞凝胶电泳技术具有灵敏、快速、简便、直观等优点 ,本室曾作过系统研究[1 ] 。但是 ,和其他常用方法一样 ,该技术也不能检测特定基因的ＤＮＡ链断裂。而一些重要的基因如癌基因和抑癌基因的ＤＮＡ损伤与致突变 致癌效应的关系非常密切 ,因此检测这些基因的ＤＮＡ链断裂可能更有利于阐明链断裂剂的作用特点和机制 ,具有更加重要的意义。国外有人利用连接介导聚合酶链反应 (Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＭｅｄｉａｔｅｄＰ…     

彗星试验非荧光染色研究

目的 为了建立一种非荧光染色的彗星试验。方法 将Feulgen法，甲基绿染色法，全染料（stains-all)法和银染法等几种非荧光DNA特异染色方法试用于慧量试验，并与溴化乙锭（EB）染色进行了比较。结果 在所试验的染色法中，侵银染法有满意的效果，染色清晰，“彗星”头和尾的边界易于判断，染色持久，敏感性高，可染出EB不能染出的DNA小片段，得到“慧星”头长和尾长均为EB染色的2倍以上，安全，价廉。结论 银染法摒弃了EB染色的不足，在彗星试验中可以替代EB染色，为彗星试验的进一步推广提供了可能。     

苯并[a]芘诱导的细胞恶性转化对DNA甲基化转移酶的影响

目的研究苯并[a]芘(B[a]P)诱导的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化过程对DNA甲基化转移酶(DNMTs)表达水平及活性的影响。方法以野生型小鼠胚胎成纤维细胞(polβ+/+)和BaP长期多次染毒构建的小鼠胚胎成纤维恶性转化细胞(polβ-T)为研究对象,采用RT-PCR和Western-blot分别检测两种细胞中dnmts(dnmt1、dnmt3a和dnmt3b)的mRNA及蛋白表达水平,同时用DNA甲基转移酶活性/抑制分析试剂盒检测DNMTs的酶活性。结果 polβ-T细胞dnmt1和dnmt3b的mRNA相对表达量分别为(0.940±0.033)和(0.905±0.062),均高于polβ+/+细胞[(0.560±0.031)和(0.666±0.041)],差异有统计学意义(P<0.05)。polβ-T细胞DNMT1和DNMT3b蛋白相对表达量分别为2.172±0.089和1.134±0.144,亦均高于polβ+/+细胞(1.311±0.050和0.820±0.106),差异具有统计学意义(P<0.05)。两种细胞DNMT3a蛋白和mRNA相对表达水平均无显著性差异。酶活性检测结果显示,与polβ+/+细胞[(329.48±52.11)OD·h-1·mg-1]相比,polβ-T细胞甲基化转移酶活性[253.70±20.56)OD·h-1·mg-1]降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 dnmt1和dnmt3b的异常表达以及DNMTs酶活性的改变可能参与苯并[a]芘诱导的细胞恶性转化过程。     

DNA修复基因OGG1研究进展

细胞正常有氧代谢和外源性物理、化学及生物因素均可使机体产生活性氧自由基,大量研究证实:自由基可攻击DNA形成多种类型的氧化损伤.在众多的DNA氧化损伤中,8-羟基鸟嘌呤(8-oxoguanine,8-oxoG)形成频率最高、致突变性最强,可导致G:C→T:A颠换,该突变与肿瘤的发生发展、机体细胞的老化及某些退行性疾病均有密切关系.体内特异识别8-oxoG并将其切除修复的酶被称为8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(8-oxoguanine DNA glycosylase),简称OGG1,在人叫做hOGG1.本文将对OGG1的结构与功能、表达与调节、氧化损伤与肿瘤的关系及其研究进展作一概述.     

hOGG1基因低表达对DNA氧化损伤及修复的影响初探

背景与目的:初步探讨采用核酶技术获得的hOGG1基因低表达的细胞对氧化剂诱导的DNA氧化损伤与修复作用的影响。材料与方法:以A549细胞和通过稳定转染hOGG1核酶而获得的hOGG1低表达的A549_R细胞为研究对象,分别以重铬酸钾和过氧化氢为受试物,比较两种细胞DNA损伤与修复的差异。彗星试验检测不同浓度受试物作用下两种细胞的彗星细胞率和DNA迁移长度;改良彗星试验比较两种细胞在去除受试物后孵育0、30、60、120和180min时的修复情况。结果:重铬酸钾和过氧化氢对A549_R细胞的DNA损伤效应敏感,在一些浓度下其彗星细胞率和DNA迁移长度明显高于A549细胞(P<0.05);A549_R细胞的DNA修复能力显著低于A549细胞(P<0.05)。结论:hOGG1基因的低表达可以增加细胞对氧化剂诱导的DNA损伤的敏感性,降低细胞DNA的修复能力。