免疫调控相关基因C12orf28在免疫组织中的分布特征

目的：制备抗人C12orf28多克隆抗体,明确C12orf28编码蛋白在免疫组织中的分布特征。方法选取免疫原性高、特异性强的羧基端257个氨基酸作为目的片段,以人外周血单个核细胞（PBMC）cDNA为模板,采用PCR获得目的基因C12orf28C257;构建其原核表达载体pET32a（＋）-C12orf28C257,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）,异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白;将重组蛋白免疫大耳白大白兔制备兔源性多克隆抗体,采用ELISA和Western blot分析检测多克隆抗体效价和特异性,采用Western blot明确C12orf28的组织分布特征。结果 PCR扩增得到C12orf28C257目的基因片段,诱导表达重组蛋白并制备了其多克隆抗体。ELISA分析结果显示,多克隆抗体效价＞1︰1.28×106,Western blot分析鉴定得出多克隆抗体具有较高的特异性。结论未知功能基因C12orf28在胎儿肠、淋巴、胸腺和心肌等组织中均有不同程度的表达。     

四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤模型的建立和优化

目的通过单次腹腔注射不同剂量的四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝损伤,检测小鼠血浆转氨酶水平的变化,建立适合本研究的小鼠模型。方法采用6~8周龄雄性C57BL/6小鼠单次腹腔注射CCl4诱导急性肝损伤。比较不同剂量的CCl4诱导急性肝损伤小鼠的血浆转氨酶水平。将182只小鼠随机分出32只。32只小鼠随机分为3组CCl4实验组(每组8只)和正常对照组(8只),分别腹腔注射0.1%、0.2%、0.3%的CCl4橄榄油溶液(10 ml/kg)或等体积橄榄油。注射12小时后取血,检测血浆丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。比较0.1%和0.2%剂量组小鼠不同时间点血浆转氨酶水平的变化。将剩余150只小鼠随机分为正常对照组(10只)、实验Ⅰ组(0.1%剂量,70只)、实验Ⅱ组(0.2%剂量,70只),实验组小鼠在造模6、12、16、20、24、48、72小时后取血,检测血浆ALT、AST的水平。结果与正常对照组相比,分别用0.1%、0.2%、0.3%CCl4处理后12小时小鼠血浆ALT、AST均明显升高(P0.05),并呈剂量依赖性。与正常对照组相比,0.1%和0.2%剂量组小鼠血浆ALT、AST的水平在早期均呈上升趋势,并分别在16小时和20小时达到高峰,随后逐渐下降,在72小时接近至正常水平。结论单次腹腔注射CCl4诱导小鼠急性肝损伤呈剂量依赖性。0.1%剂量的CCl4以及该剂量处理后16小时是建立C57BL/6小鼠急性轻度肝损伤的合适剂量与检测转氨酶水平的合适时间点。     

气管滴注法与雾化吸入法建立小鼠急性肺损伤模型及其效果比较

目的：比较脂多糖（LPS）气管滴注法与雾化吸入法建立的小鼠急性肺损伤（ALI）模型,确立更为有效的小鼠肺损伤建模方法。方法20只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为生理盐水（NS）气管滴注组、NS雾化吸入组、LPS气管滴注组和LPS雾化吸入组。分别采用气管滴注法和雾化吸入法建立肺损伤模型,5 h后进行小鼠肺湿重/干重（W/D）比值测定、支气管肺泡灌洗液（BALF）蛋白含量测定、细胞分类计数及炎性细胞因子检测。结果与对照组相比,LPS气管滴注组和LPS雾化吸入组小鼠肺W/D比值,BALF中总蛋白浓度,TNF-α、IL-6、MCP-1和IL-1β等多项炎性细胞因子以及中性粒细胞数目均显著升高（P均＜0.05）;NS气管滴注组较NS雾化吸入组炎症背景高;LPS气管滴注组较LPS雾化吸入组各项肺部炎症指标组内差异大。结论雾化吸入方法对于建立小鼠ALI模型更有效。     

2010年度北京地区儿童手足口病住院患者病原学分布分析

目的 了解2010年北京地区儿童手足口病住院患者的病原体分布情况,为手足口病的诊断、治疗及预防提供依据.方法 本研究共采集337例手足口病住院患儿的咽拭子标本,采用肠道病毒(EV)通用型、柯萨奇病毒A16(CA16)型和肠道病毒71(EV71)型核酸检测试剂盒,应用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法进行检测.结果 肠道病毒阳性标本占63.20%(213/337).其中,EV71阳性标本占40.36%(136/337);CA16阳性标本占5.64%(19/337);其他未分型肠道病毒阳性标本占17.21%(58/337).结论 2010年北京地区儿童手足口病住院患者的病原学分布以EV71为主,非CA16和非EV71型肠道病毒感染率已显著高于CA16型肠道病毒感染.     

乳铁蛋白-DNA复合物检测评价甲型H1N1重症流感患者血浆中性粒细胞胞外诱捕网水平

目的建立乳铁蛋白-DNA复合物的相对定量检测方法,评价甲型H1N1重型流感及其他病原体感染者血浆样本中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的含量。 方法将DNA含量明确的血浆样本进行梯度稀释作为标准品,应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆中乳铁蛋白-DNA复合物含量。采用乳铁蛋白-DNA ELISA方法比较19例甲型H1N1重症流感患者与19例献血者（对照组）血浆乳铁蛋白-DNA复合物含量差异。 结果甲型H1N1重型重症流感患者血浆中乳铁蛋白-DNA复合物水平与游离DNA（cfDNA）和组蛋白-DNA复合物水平均呈正相关（r = 0.6763、P < 0.0001,r = 0.7560、P < 0.0001）。甲型H1N1重症流感患者血浆中乳铁蛋白-DNA复合物含量为[2.082（1.169,5.021）μg/ml],显著高于对照组[0.233（0.170,0.376）μg/ml],差异有统计学意义（P < 0.0001）,且乳铁蛋白-DNA复合物含量与甲型H1N1重症流感患者的急性生理与慢性健康评分（APACHEⅡ评分）呈正相关（r = 0.7379、P = 0.0005）。 结论血浆乳铁蛋白-DNA复合物含量可用于评价甲型H1N1重症流感患者NETs水平。     

胶原糖基化Glcα1和2Galβ1修饰基因(GLT25D1)敲低小鼠模型的制备与基因型鉴定

目的建立介导胶原糖基化Glcα1、2Galβ1修饰基因(GLT25D1)敲低小鼠模型,为研究其在肝脏疾病中的作用奠定基础。方法基于Cre-loxp重组酶系统,采用胚胎干细胞线性打靶技术,获得同源重组的干细胞,繁殖嵌合体,获得杂合子GLT25D1~(+/-)小鼠。随后将GLT25D1~(+/-)小鼠自交。通过PCR凝胶电泳技术对子代小鼠的基因型进行鉴定。采用Western blot技术检测GLT25D1在WT型小鼠(wild type,WT)和杂合子GLT25D1~(+/-)小鼠各组织的表达。比较WT和GLT25D1~(+/-)小鼠的生育情况、子代小鼠基因型比例及出生20天的体重差异。结果 GLT25D1~(+/-)小鼠配笼繁殖的264只子代小鼠中,杂合子GLT25D1~(+/-)小鼠152只,WT小鼠112只,无GLT25D1-/-小鼠。GLT25D1~(+/-)小鼠数量和WT小鼠数量的比值低于孟德尔遗传定律的2∶1(χ~2=9.818,P=0.002)。Western blot示GLT25D1蛋白在WT小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等重要组织中均有表达,其中在肝、脾和肺中高表达,肾和淋巴结中度表达,心和脑弱表达,GLT25D1~(+/-)小鼠各组织表达水平均低于WT型小鼠。WT和GLT25D1~(+/-)小鼠在外观和行为上无显著差异,GLT25D1~(+/-)小鼠出生后20天体重显著低于WT型小鼠(t=2.520,P=0.0177)。GLT25D1~(+/-)小鼠交配后平均每窝出生的鼠仔数目为4只,低于WT小鼠平均鼠仔数7只(t=-8.482,P0.001)。结论 GLT25D1基因敲低后会导致GLT25D1-/-胚胎致死,且影响部分GLT25D1~(+/-)小鼠正常出生,GLT25D1~(+/-)小鼠出生后20天体重减轻,繁殖能力下降。     

原发性胆汁性肝硬化患者合并骨质疏松症临床研究

目的回顾性分析原发性胆汁性肝硬化患者合并骨质疏松症的患病率并探讨其发病机制。方法选择2015年1月至2016年7月于首都医科大学附属北京地坛医院住院的原发性胆汁性肝硬化(primary biliarycholangitis,PBC)患者40例为PBC组,根据年龄和性别匹配无肝病对照组40例,比较两组患者骨密度(boneminaral density,BMD)、血清骨钙素(osteocalcin,OC)、总Ⅰ型胶原氨基端延长肽(total procollagen type 1 amino-terminal propeptide,P1NP)、Ⅰ型胶原降解产物(β-C-terminal telopeptide of typeⅠcollagen,β-CTX)和总25羟维生素D [25-hydroxy vitamin D,25(OH)VD]等指标以及PBC患者肝功能与BMD和骨代谢指标的关系。结果 PBC组患者合并骨密度异常34例(85.0%),其中骨量减少18例(45.0%),骨质疏松16例(40.0%);对照组患者合并骨密度异常11例(27.5%),其中骨量减少9例(22.5%),骨质疏松2例(5.0%),两组患者骨质疏松症患病率差异有统计学意义(χ~2=28.627,P=0.001)。PBC患者腰椎(L1～L4)和髋关节不同部位BMD均显著低于对照组(P均0.001)。PBC患者中5例发生脆性骨折,其中1例先后发生腰椎骨折和左侧股骨颈骨折,对照组患者无脆性骨折发生。Child-Pugh C级患者BMD、血清骨钙素和总25-羟维生素D水平较Child-Pugh A级和B级患者低,但差异无统计学意义(P均 0.05)。结论 PBC患者骨量减少和骨质疏松症患病率显著升高,其机制可能与血清骨钙素和总25羟维生素D水平下降有关。     

2013至2015年度某院手足口病患儿的病原学分析

目的分析2013至2015年北京大学北京地坛医院教学医院手足口病住院患者的病原体类型及分布特点,为手足口病的诊疗及预防提供关键性的指导。 方法收集2015年北京大学北京地坛医院教学医院儿科收治的手足口病住院患者共84例的咽拭子及粪便标本,提取病毒RNA,采用实时荧光聚合酶链反应（real time-PCR）法,进行肠道病毒（EV）通用型、肠道病毒71（EV71）型及柯萨奇A16（CoxA16）型肠道病毒核酸检测,并与2013年和2014年度本院手足口病病原学结果进行对比分析。 结果2015年手足口病患者的EV阳性率为86.9%（73/84）,其中EV71型肠道病毒占44.05%（37/84）,非EV71非CoxA16型肠道病毒占40.48%（34/84）,CoxA16型肠道病毒占2.38%（2/84）。与2013年相比,2015年非EV71非CoxA16型肠道病毒感染率显著下降（χ² = 10.20、P = 0.001）,差异具有显著统计学意义,而EV71型感染率显著升高（χ² = 28.38、P < 0.001）,差异具有极显著统计学意义;与2014年相比,2015年非EV71非CoxA16型肠道病毒感染率显著升高（χ² = 15.50、P < 0.001）,差异均具有极显著统计学意义;EV71型感染率有所下降,但差异无统计学意义（χ² = 1.89、P = 0.019）。 结论2013至2015年手足口病病原学分布变化较大,2013年本院手足口病患者以非EV71非CoxA16型肠道病毒感染为主;2014年以EV71型肠道病毒感染为主;2015年以EV71型和非EV71非CoxA16型肠道病毒感染为主,在未来的手足口病防控中应在重视EV71型肠道病毒感染的同时,重视非EV71非CoxA16型肠道病毒感染。     

CNP2线粒体定位信号以及磷酸酯酶活性对抑制HIV-1 Gag蛋白组装作用的影响

目的研究CNP2在线粒体上的定位以及磷酸酯酶活性是否参与抑制HIV-1病毒颗粒组装。 方法采用RT-PCR扩增野生型CNP2编码区,插入到真核表达载体pcDNA5,构建融合蛋白Flag-CNP2的表达质粒pcDNA5-Flag-CNP2。应用融合PCR诱导突变法构建CNP1及CNP2突变表达载体。CNP表达载体分别与HIV-1假病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG、pLenti6-EGFP共同瞬时转染293T细胞。集落形成实验检测上清病毒滴度,Western blot检测细胞中Gag蛋白p55、p24以及细胞培养上清中p24的表达情况。 结果与对照组比较,CNP2、CNP1、CNP2-S9/22A可以显著抑制细胞中病毒的释放,培养上清中病毒滴度显著降低（滴度分别为5.66、4.20、5.75、6.63 Log₁₀IU/ml,NC组为7.65 Log₁₀ IU/ml;t = 58.23、17.24、12.77、6.131,P = 0.0035、0.0066、0.0004、0.0039）。CNP1抑制HIV-1病毒颗粒组装作用更强,Western blot检测培养上清中病毒蛋白完全p24消失。磷酸酯酶结构域（2HM）突变后CNP2抑制HIV-1病毒颗粒组装的作用显著降低。 结论CNP2抑制HIV-1病毒颗粒组装需要磷酸酯酶结构域（2HM）的参与,CNP2的线粒体定位信号可能会影响其抑制HIV病毒颗粒组装的作用。