pri-mir-302/367重组慢病毒载体的构建及其下游调节基因的鉴定

目的：构建可诱导表达pri-mir-302/367 的慢病毒载体,并研究miR-302/367家族基因miＲ-302a/b/c/d和miＲ-367及其下游调节基因OCT4、SOX2和NANOG在 HeLa细胞中的诱导性表达。方法：以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增pri-mir-302/367基因。经双酶切后连接入pLV-TRE质粒,构建pLV-TRE-302慢病毒重组体,酶切及测序予以鉴定。将重组质粒和辅助质粒共同转染293 FT细胞,并测定病毒滴度。用病毒转染HeLa细胞,强力霉素（doxycline,DOX）诱导后,通过real-time PCR测定miR-302/367家族基因及其下游调节基因的表达。实验分为诱导组（DOX+）、非诱导组（DOX-）和空白组（blank）。结果：酶切及测序证实重组慢病毒载体pri-mir-302/367构建成功,病毒滴度为5×106 TU/ml;DOX诱导72 h后,real-time PCR结果显示诱导组高于非诱导组和空白组（P＜0.05,其中miR-302a：PDOX+ vs. DOX-=0.032,PDOX+ vs. blank=0.048;miR-302b：PDOX+ vs. DOX-=0.001,PDOX+ vs. blank=0.001;miR-302c：PDOX+ vs. DOX-=0.000,PDOX+ vs. blank=0.000;miR-302d：PDOX+ vs. DOX-=0.002,PDOX+ vs. blank=0.047;miR-367：PDOX+ vs. DOX-=0.001,PDOX+ vs. blank=0.001;OCT4：PDOX+ vs. DOX-=0.000,PDOX+ vs. blank=0.001;SOX2：PDOX+ vs. DOX-=0.000,PDOX+ vs. blank=0.000;NANOG：PDOX+ vs. DOX-=0.000,PDOX+ vs. blank=0.000）,而非诱导组与空白组相比差异无统计学意义（P ＞0.05,其中miR-302a：Pblank vs. DOX-=0.057;miR-302b：Pblank vs. DOX-=0.832;miR-302c：Pblank vs. DOX-=0.445;miR-302d：Pblank vs. DOX-=0.979;miR-367：Pblank vs. DOX-=0.161;OCT4：Pblank vs. DOX-=0.051;SOX2：Pblank vs. DOX-=0.060;NANOG：Pblank vs. DOX-=0.078）。结论：成功构建了携带人miR-302/367可控性慢病毒载体,为后续的重编程研究奠定了实验基础。     

Oxymatrine Improves TNBS-induced Colitis in Rats by Inhibiting the Expression of NF-κB p65

Inflammatory bowel disease is thought to be regulated by the balance between Th1 and Th2 cytokines secreted by T cells, and NF-κB p65 also plays a predominant role in the intestinal inflammation. We evaluated the potency of oxymatrine, one of active components of Sophora Root, in inhibiting the immune responses and inflammation in 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-induced colitis. The inflammation was markedly ameliorated in the oxymatrine-treated rats. The level of IL-2 was increased and that of IL-10 was decreased in colon tissue in the rat model, which was reversed by the treatment of oxymatrine. Moreover, the elevated expression of NF-κB p65 in colon tissue in the model was also improved by oxymatrine treatment. Our results suggest that oxymatrine might be beneficial for the abnormal immune responses and inflammation by regulating the unbalance of Th1 and Th2 cytokines secretion and inhibiting the expression of NF-κB p65 in colon tissue.     

氧化苦参碱调控RhoA/ROCK信号通路介导溃疡性结肠炎E-cadherin及TGF-β的影响

目的:通过检测小鼠结肠组织中Rho激酶(ROCK),E-钙黏蛋白(E-cadherin)及转化生长因子-β(TGF-β)相关指标变化,探讨氧化苦参碱通过RhoA/ROCK信号通路介导上皮-间充质转化,防治溃疡性结肠炎(UC)及其相关癌变的机制。方法:48只SPF级Balb/c雄性小鼠随机分为正常组,模型组,氧化苦参碱低、中、高剂量组(25,50,100 mg·kg~(-1)),Rho激酶抑制剂(Y-27632)组(10 mg·kg~(-1))。采用3%葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮用1周法制备UC模型,腹腔注射的方式给药,正常组和模型组腹腔注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。自造模起,每天记录小鼠体质量、粪便的性状、隐血及肉眼血便情况,连续给药1周,第8天处死全部小鼠,评估UC小鼠疾病活动指数(DAI);对小鼠结肠进行病理学评分;采用透射电镜观察各组小鼠结肠组织超微结构变化;酶联免疫吸附法测定法(ELISA)检测结肠组织TGF-β含量;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测小鼠结肠组织Rho激酶-1(ROCK-1),Rho激酶-2(ROCK-2),E-cadherin,TGF-β蛋白及mRNA的表达。结果:与正常组比较,模型组光镜下见黏膜及黏膜下层大量炎性细胞浸润、腺体排列紊乱、伴有不同程度肠黏膜缺损、甚有溃疡形成,电镜下见肠上皮细胞表面微绒毛稀疏,细胞连接间隙增宽,杯状细胞减少,细胞器肿胀,DAI评分显著升高(P 0. 01),结肠组织ROCK-1,ROCK-2蛋白和mRNA含量均显著升高(P 0. 01),结肠长度显著降低(P 0. 01),结肠组织E-cadherin,TGF-β蛋白和mRNA表达显著减少(P 0. 01);与模型组比较,各治疗组小鼠光镜及电镜下病理表现均有不同程度的改善,DAI评分显著降低(P 0. 01),结肠长度显著增加(P 0. 01),结肠组织ROCK-1,ROCK-2蛋白和mRNA表达水平显著下降(P 0. 01),E-cadherin,TGF-β蛋白和mRNA表达显著上升(P 0. 01);与氧化苦参碱中剂量组比较,氧化苦参碱低、高剂量组ROCK-1,ROCK-2蛋白和mRNA含量均明显升高(P 0. 05,P 0. 01),TGF-β和E-cadherin蛋白和mRNA含量显著降低(P 0. 01)。结论:氧化苦参碱可通过下调Rho激酶表达,上调E-cadherin和TGF-β表达,诱导肠上皮细胞凋亡,介导上皮-间充质转化,从而达到缓解溃疡性结肠炎的功效。     

大黄不同炮制品在新型冠状病毒肺炎治疗中的作用

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19),简称新冠肺炎,以其广泛的传染性和较强的致病性,目前仍在全球流行,新冠疫情已构成国际关注的突发公共卫生事件,威胁着全人类的生命健康。中医药在我国新冠肺炎的防治上发挥了独特作用,目前我们国家已取得阶段性的抗疫胜利。自古至今,大黄在临床上运用广泛,严重急性呼吸综合征冠状病毒是引起人类严重急性呼吸综合征(SARS)的病原体,研究[1]证实大黄提取物具有抗SARS病毒作用。     

复方苦参汤对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中i NOS和COX-2蛋白表达的影响

目的:观察复方苦参汤对溃疡性结肠炎(UC)小鼠模型结肠黏膜诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶2(COX-2)蛋白的作用机制。方法:将20只BALB/c小鼠随机分为4组:正常组、模型组、复方苦参汤组和美沙拉嗪组,每组5只。先适应性喂养1周,在第8天,除正常组外,其余3组分别予3%葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮用1周制备实验性UC小鼠模型。同时在造模第1天开始,正常组和模型组每日均以蒸馏水灌胃,复方苦参汤组及美沙拉嗪组每日分别予复方苦参汤、美沙拉嗪灌胃,连续治疗1周。取各组结肠组织固定后HE染色病理观察,采用Western Blot检测各组小鼠结肠组织iNOS及COX-2蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组iNOS及COX-2蛋白表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,两给药组iNOS及COX-2蛋白表达量显著降低(P<0.01)。结论:复方苦参汤治疗UC的作用机制可能与抑制结肠组织i NOS及COX-2蛋白表达有关。     

理肠四方治疗溃疡性结肠炎的病机

目的：通过总结前期动物实验结果，分析比较理肠四方（乌梅丸、白头翁汤、参苓白术散、痛泻要方）治疗溃疡性结肠炎疗效。 方法：收集笔者近期发表理肠四方治疗溃疡性结肠炎相关文章的结论，分别从动物实验中症状、体征、病理改变、细胞因子及其蛋白表达、血液黏附分子、细胞凋亡及调控基因几方面进行比较，分析溃疡性结肠炎中医的病机和理肠四方的中医作用机制。理肠四方即乌梅丸（出自《伤寒论》《金匮要略》），由乌梅、细辛、干姜、黄连、当归、附子、蜀椒、桂枝、人参（生晒参）、黄柏等药组成，主治蛔厥证又主久利。白头翁汤（出自《伤寒论》），由白头翁、黄连、黄柏、秦皮等药组成，有清热解毒止痢等作用，主治热痢。参苓白术散（出自《太平惠民和剂局方》）。由莲子肉、薏苡仁、砂仁、桔梗、白扁豆、茯苓、人参（生晒参）、甘草、白术、山药等药组成，有益气健脾，渗湿止泻之功，主治脾虚泄泻。痛泻要方（来源于《景岳全书》），由白术、白芍、陈皮、防风4味药组成，有舒肝健脾止泻等作用，主治肝旺脾虚、肠鸣腹痛泄泻。 结果：①溃疡性结肠炎由于慢性久痢，正气已虚。邪气未尽，其治疗如专事清化导滞则徒伤其正，如一味扶正兜涩则恋邪碍积。唯扶正祛邪是其正治，与乌梅丸的主治相一致。②而白头翁汤以清热燥湿，凉血止痢为主治大法，与本虚为主的溃疡性结肠炎不完全相同。③参苓白术散有益气健脾，渗湿止泻之功，与兼外邪的溃疡性结肠炎亦不完全相同。④痛泻要方主要治疗土虚木乘，脾受肝制。升降失常所致泄泻。虽与溃疡性结肠炎的主要病机脾虚湿盛之脾虚相吻合，但对溃疡性结肠炎缓解期补脾之力较参苓白术散稍弱，故乌梅丸疗效最好，白头翁汤次之，叁苓白术散居中，痛泻要方稍差。 结论：溃疡性结肠炎可归属于中医“休息痢”范畴，其病机与乌梅丸的主治相一致。其他三方与之不完全一致，所以乌梅丸是治疗溃疡性结肠炎最有效的方剂。中医辨证施治是取得最佳疗效的前提，动物实验的造模必须符合中医证型。     

理肠四方治疗溃疡性结肠炎的病机

目的:通过总结前期动物实验结果,分析比较理肠四方(乌梅丸、白头翁汤、参苓白术散、痛泻要方)治疗溃疡性结肠炎疗效。方法:收集笔者近期发表理肠四方治疗溃疡性结肠炎相关文章的结论,分别从动物实验中症状、体征、病理改变、细胞因子及其蛋白表达、血液黏附分子、细胞凋亡及调控基因几方面进行比较,分析溃疡性结肠炎中医的病机和理肠四方的中医作用机制。理肠四方即乌梅丸(出自《伤寒论》《金匮要略》),由乌梅、细辛、干姜、黄连、当归、附子、蜀椒、桂枝、人参(生晒参)、黄柏等药组成,主治蛔厥证又主久利,白头翁汤(出自《伤寒论》),由白头翁、黄连、黄柏、秦皮等药组成,有清热解毒止痢等作用,主治热痢。参苓白术散(出自《太平惠民和剂局方》),由莲子肉、薏苡仁、砂仁、桔梗、白扁豆、茯苓、人参(生晒参)、甘草、白术、山药等药组成,有益气健脾,渗湿止泻之功,主治脾虚泄泻。痛泻要方(来源于《景岳全书》),由白术、白芍、陈皮、防风4味药组成,有舒肝健脾止泻等作用,主治肝旺脾虚、肠鸣腹痛泄泻。结果:①溃疡性结肠炎由于慢性久痢,正气已虚,邪气未尽,其治疗如专事清化导滞则徒伤其正,如一味扶正兜涩则恋邪碍积,唯扶正祛邪是其正治,与乌梅丸的主治相一致。②而白头翁汤以清热燥湿,凉血止痢为主治大法,与本虚为主的溃疡性结肠炎不完全相同。③参苓白术散有益气健脾,渗湿止泻之功,与兼外邪的溃疡性结肠炎亦不完全相同。④痛泻要方主要治疗土虚木乘,脾受肝制,升降失常所致泄泻,虽与溃疡性结肠炎的主要病机脾虚湿盛之脾虚相吻合,但对溃疡性结肠炎缓解期补脾之力较参苓白术散稍弱,故乌梅丸疗效最好,白头翁汤次之,参苓白术散居中,痛泻要方稍差。结论:溃疡性结肠炎可归属于中医“休息痢”范畴,其病机与乌梅丸的主治相一致,其他三方与之不完全一致,所以乌梅丸是治疗溃疡性结肠炎最有效的方剂。中医辨证施治是取得最佳疗效的前提,动物实验的造模必须符合中医证型。     

邱明义经方治疗胃痞病经验

正邱明义,湖北中医药大学教授,博士生导师,主任医师。邱教授多年致力于伤寒研究,临证40余载,颇擅用经方治疗脾胃疾病,疗效显著。笔者有幸师从先生,现将其经方治疗胃痞病经验介绍如下。胃痞病又称痞满,其以症状学命名,是临床上十分常见的一种脾胃系病证。它是指以心下(指胃脘)痞塞,胸膈胀满,触之无形,按之柔软,压之无痛为主要症状的病证,其发病较缓慢,症状时轻时重,易反复发作,且病情漫长。中医胃痞病范畴包含西医消化系统疾病     

复方苦参结肠溶胶囊对溃疡性结肠炎患者结肠粘膜IκB-α表达的作用

目的 观察复方苦参结肠溶对溃疡性结肠炎(UC)患者(湿热内蕴证)结肠粘膜IκB-α蛋白表达的作用,并对其作用机制进行初步探讨.方法 经结肠镜及病理证实的24例UC患者,随机分为中药组和西药组,中药组16例用复方苦参结肠溶治疗,西药组8例用美沙拉嗪治疗,共治疗8周.采用免疫组化法检测两组治疗前后IκB-α蛋白的阳性细胞表达率 .结果 治疗前全部结肠粘膜IκB-α蛋白阳性细胞表达率明显高于治疗后(P＜0.01),治疗后复方苦参结肠溶组结肠粘膜IκB-α蛋白阳性细胞表达率与美沙拉嗪组无明显统计学意义(P＞0.05 ).结论 复方苦参结肠溶组使UC患者结肠粘膜IκB-α蛋白阳性细胞表达率明显降低,这可能是其治疗UC的作用机理之一 .     

乌梅丸对实验性结肠炎大鼠脾脏组织Delta-阿片受体表达的影响

目的 观察乌梅丸对实验性结肠炎大鼠脾脏组织Delta-阿片受体(DOR)的mRNA和蛋白表达的影响,旨在研究乌梅丸治疗结肠炎的新机制.方法 56只SD大鼠随机分成空白对照组、结肠炎模型组、美沙拉嗪组、乌梅丸组(每组14只).除空白对照组外,其他3组均应用2,4,6-三硝基苯磺酸灌肠.模型建成2天后,空白对照组和结肠炎模型组分别以蒸馏水每只3ml灌胃,美莎拉嗪组用美莎拉嗪混悬液(浓度50g/L)、乌梅丸组用乌梅丸液(浓度0.515g/L)以每只3ml灌胃,连续给药15天后取脾脏组织,应用real time-PCR检测DOR的mRNA的表达,应用Western blot技术检测DOR蛋白的表达.结果 与空白对照组相比,结肠炎模型组DOR的mRNA和蛋白表达显著升高(P＜0.05);与结肠炎模型组相比,乌梅丸组、美沙拉嗪组DOR的mRNA和蛋白表达显著下降(P＜0.05),但乌梅丸组和美沙拉嗪组DOR的mRNA和蛋白表达均无显著差异(P＞0.05).结论 乌梅丸可能通过下调脾脏组织DOR的mRNA和蛋白表达,发挥治疗结肠炎的作用.