GMP法玻璃化冷冻人胚胎的效果观察

目的探索GMP法玻璃化冷人胚胎的可行性。方法选用IVF中多精受精的4-10细胞阶段的胚胎为研究对象，先后在玻璃化1液（10％乙二醇＋10％二甲亚砜）和玻璃化2液（20％乙二醇＋20％二甲亚砜＋0．3M蔗糖）中分别平衡1mim和0．5mim，然后用GMP管虹吸胚胎直接浸入液氮。其结果与常规的程序化慢冻进行比较。结果GMP法的存活率、胚胎完整率、卵裂球存活率比程序化慢冻法更高（分别为94．4％对73．9％，P〈0．01；79．6％对33．9％，P〈0．01；91．6％对67．8％；P〈0．01），但卵裂球完全死亡率更低（0％对10、4％；P〈0．01）。结论GMP法玻璃化冷冻人胚胎是可行的。     

重组MHCⅠ类分子K^b-EGFP分子的构建及表达

目的 构建绿色荧光蛋白标记的MHCⅠ类分子K^b(K^b-EGFP融合蛋白)，并在哺乳动物细胞中获得功能性表达。方法 RT-PCR的方法获得小鼠MHCⅠ类分子K^b cDNA，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP分子的上游，脂质体转染COS-7细胞，G418加压筛选获得抗性重组细胞。荧光显微镜下观测重组分子的表达及胞内定位情况。结果 分子克隆的方法获得了预期的重组质粒，质粒经DNA序列测定证实阅读框无误，转染COS-7细胞后的抗性克隆胞浆内可以观察到明亮的绿色荧光，特征性地分布于细胞质膜，及核周、膜下的囊泡结构中。结论 所构建的K^b-EGFP融合蛋白在细胞内表达后具有MHCⅠ类分子的特征性分布，提示该重组分子具有野生型MHCⅠ类分子的生物学特性和胞内分布特征，为进一步深入研究MHCⅠ类分子胞内动态分布及分子功能提供了良好的细胞和分子模型。     

内源性H2S在CCK-8减轻脂多糖所致急性肺损伤中的作用

目的：探讨内源性硫化氢(H₂S)在八肽胆囊收缩素(CCK-8)减轻脂多糖（LPS）所致急性肺损伤(ALI)中的作用。方法: 将84只SD大鼠随机分为正常对照组、LPS组（经气管内滴注LPS复制ALI）、NaHS(H₂S供体)+LPS组、炔丙基甘氨酸［胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）抑制剂，PPG］+LPS组、CCK-8+LPS组、PPG+CCK-8+LPS组和CCK- 8组。给药后分别于4 h和8 h处死动物，测定肺湿/干比值；光镜观察肺组织形态学改变；化学法检测血浆H₂S含量，肺组织MDA含量、MPO活性和CSE活性；放免法检测肺组织P-selectin含量；RT-PCR检测肺组织CSE mRNA的表达；并行支气管肺泡灌洗，检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量。结果: 气管内滴注LPS可引起肺组织明显的形态学改变；肺湿/干比值、BALF中蛋白含量及肺组织MDA、MPO活性和P-selectin水平增高；血浆H2S含量、肺组织CSE活性及CSE mRNA表达下降。预先给予NaHS或CCK-8可显著减轻LPS所致的上述改变，且血浆H₂S含量、肺组织CSE活性及CSE mRNA表达高于相应的LPS组；预先给予PPG可加重LPS所致的肺损伤，而血浆H₂S含量、肺组织CSE活性及CSE mRNA表达分别低于相应的LPS组和CCK-8+LPS组。结论: CCK-8可通过内源性H₂S介导的抗氧化、抑制PMN黏附聚集等效应发挥减轻LPS所致肺损伤的作用。     

bFGF诱导人胚视网膜色素上皮细胞转分化的研究

目的 探讨bFGF体外诱导早期人胚视网膜色素上皮（RPE）细胞转分化现象及其分子机制,为视网膜发育的进一步基础研究和临床RPE细胞移植奠定基础.方法 取4～6代人胚（6 w～10 w）RPE细胞,bFGF（20 ng/ml）诱导培养（4 d～6 d）后观察RPE细胞形态学的改变,用免疫细胞化学作转分化RPE细胞鉴定.RT-PCR分析转分化RPE细胞小眼畸形基因（MITF）的表达.结果 bFGF诱导培养后的人胚RPE细胞呈现类神经样细胞表型,不仅表达自身上皮细胞标记物角蛋白（Keratin）,同时还表达多种神经视网膜上皮细胞标记物（MAP2、GS、GFAP、Peripherin、Opsin,但不表达NCAM）;用RT-PCR方法没有检测到转分化RPE细胞MITF-A mRNA表达.结论 早期人胚RPE细胞的发育具有一定的可塑性,bFGF可以诱导早期人胚RPE细胞表达多种神经视网膜上皮细胞标记物,可能是通过抑制MITF-A的分子信号通路.     

中国92例HIV/AIDS患者HIV-1 gp41 2F5和4E10中和抗体表位变异研究

目的 探讨92例HIV/AIDS患者HIV-1病毒近膜端(membrane proximal external re-gion,MPER)中和抗体2F5和4E10保守表位ELDKWA、NWFDIT氨基酸变异特点,为中国HIV/AIDS患者免疫治疗以及疫苗设计提供数据.方法 Nest-PCR扩增HIV-1 env区gp41段基因,核酸序列测定,翻译为氨基酸与HIV-1 Sequence Database HXB Ⅱ参考株中和抗体表位数据比对,分析2F5、4E10中和表位氨基酸变异情况.结果 92例HIV/AIDS患者HIV-1外膜蛋白env gp41段中和抗体2F5、4E10保守表位氨基酸均存在突变;2F5中和抗体表位主要有E662A(14.1%)、K665S(17.4%)、A667K(16.3%)突变;4E10中和抗体表位主要有N671S(13.0%)、D674S(3.3%)、T676S(16.3%)突变;CRF_B'C亚型与B'亚型的2F5和4E10表位氨基酸突变差异具有统计学意义(P<0-05);CRF_B'C与CRF01_AE亚型2F5表位突变差异具有统计学意义(P<0.05);B'亚型缓慢进展者、HIV感染者和AIDS患者的4E10表位氨基酸突变差异具有统计学意义(P<0.05).结论 92例HIV/AIDS患者HIV.1包膜蛋白env gp41段中和抗体2F5、4E10中和表位氨基酸存在突变,且变异多样化;不同亚型中和抗体保守表位氨基酸位点变异有差异;B'亚型4E10中和抗体表位变异可能与疾病进展有一定联系.     

桑色素对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响

目的:研究桑色素(morin)对小鼠T淋巴细胞活化、增殖和细胞周期的影响。方法:以刀豆蛋白A(ConA)刺激培养的淋巴结来源的小鼠淋巴细胞,再以不同终浓度的morin与T细胞共培养,利用流式细胞术(FCM),检测早期T细胞活化的标志CD69分子的表达,以羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂(CFDA-SE)染色检测T细胞的增殖;以碘化丙锭(PI)染色分析T细胞的细胞周期。结果:小鼠T细胞培养6 h后,未经ConA刺激的对照组中CD69 T的细胞比率为(2.97±0.12)%,经ConA刺激的CD69 T细胞的比率明显增高,达到(72.52±0.66)%,与对照组相比差别明显(P<0.01)。终浓度为25、50、100μmol/L的morin均下调CD69 T细胞的比率,其中,100μmol/L的morin抑制作用最强,为(48.95±0.81)%,与对照组比较具有统计学意义(P<0.01)。CFDA-SE染色分析显示,ConA组培养48 h和72 h的T细胞的增殖指数(PI)分别为(1.58±0.04)和(1.95±0.02),各浓度的morin对ConA刺激的T细胞增殖,具有明显地抑制作用,以100μmol/L的morin抑制作用最明显。培养48 h的ConA组T细胞的PI为(1.02±0.02)、培养72 h的ConA组T细胞的PI为(1.03±0.01),与相应时间的对照组比较,均有统计学意义(P<0.01)。PI染色后流式细胞术分析的结果表明,ConA组处于S期的T细胞的比率为(27.05±0.39)%,显著高于对照组的比率(5.10±0.07)%。morin组中S期的细胞比率较高。结论:Morin可显著抑制ConA刺激的T细胞活化及增殖;其对增殖的抑制作用主要表现为S期的细胞的阻滞。     

儿童呼吸道腺病毒基因分型方法的建立及其应用

目的 利用PCR技术,建立引起儿童呼吸道感染的腺病毒的基因分型方法,便于推广和应用.方法 分析GenBank中不同型别腺病毒的六邻体基因序列特点,设计不同型腺病毒的特异性引物,以PCR方法进行基因分型,建立基因分型方法,并利用此方法对广州市2004年7月某幼儿园流行的腺病毒感染进行了基因分型.结果 建立了呼吸道腺病毒的基因分型方法.广州市2004年7月某幼儿园流行的腺病毒为3型腺病毒.结论 PCR方法可进行腺病毒的基因分型,且简便、结果可靠,便于推广应用.     

Nestin、CK19及insulin等在胚胎胰腺发育中的表达

目的:研究Nestin、CK19、胰岛素、胰高血糖素及生长抑素在胚胎胰腺发育中的表达,探讨胰岛细胞分化发育的机制。方法:采用免疫组化SABC法及免疫组化双染法(LAB SA),对30例6～14wk人胚胎胰腺中,Nestin、CK19、胰岛素,胰高血糖素及生长抑素阳性的细胞进行定位。结果:(1)胚胎胰腺发育中Nestin阳性细胞存在于胰腺的间质,数量极少;CK19在胰腺导管上皮分化中持续表达,呈强阳性;(2)7wk胰腺导管上皮开始分化出胰岛细胞,胰岛素、胰高血糖素及生长抑素表达阳性,三者的表达并无时段差异性;随着胎龄的增加,阳性细胞数增加,14wk时胰岛逐渐形成,表达达到高峰。结论:胚胎胰腺的发育中,胰腺间质存在胰腺干细胞;胚胎早期胰腺导管上皮细胞开始分化并分泌胰岛素,其自分泌的激素可能参与调节胰岛细胞的迁移和胰岛的形成。     

不同胎龄的胎儿和少儿皮肤中bax,bcl-2和p53基因表达的变化

目的：探讨凋亡相关基因bax, bcl-2和p53在不同胎龄的胎儿皮肤和少儿皮肤组织中表达的变化特征及其可能的生物学意义。方法： 运用末端脱氧核糖转移酶介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺口标记技术(TUNEL)检测18例不同胎龄(13-32周)的胎儿皮肤和6例少儿皮肤组织中细胞凋亡的变化后，提取这些皮肤组织中的总RNA，分离mRNA，用RT-PCR方法检测bax, bcl-2和p53基因在不同组织中的表达变化特征。结果： 随着胎儿的生长发育，皮肤组织中的细胞凋亡率逐渐增加。在早期妊娠胎儿的皮肤中，bcl-2基因表达水平较高，随着胎龄的增加，bcl-2基因的转录本含量逐渐降低，在少儿的皮肤组织中，这种基因的表达量明显低于早期妊娠胎儿皮肤（P<0.01）。与bcl-2基因不同，在早期妊娠胎儿皮肤组织中，p53基因表达水平较低，而在晚期妊娠胎儿和少儿的皮肤内，该基因表达较强，而bax基因在不同发育时期的胎儿和少儿皮肤组织中表达差异不显著（P>0.05）。结论： 晚期妊娠胎儿和少儿皮肤组织中细胞增殖减缓，细胞趋向分化或凋亡的增加可能与p53基因表达增强，bcl-2表达降低相关；而p53表达降低，bcl-2表达升高可能是早期妊娠胎儿皮肤中细胞凋亡较少的机制之一。     

诺如病毒衣壳蛋白重组人3型腺病毒的构建

目的 制备表达诺如病毒衣壳蛋白的重组人3型腺病毒.方法 将诺如病毒衣壳蛋白基因(Noro-orf2)克隆到腺病毒穿梭载体pBSE3CMV-egfp上,与线性化人3型腺病毒骨架质粒pBRAdv3共电转化感受态大肠杆菌BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,带Noro-orf2基因的表达框置换腺病毒E3区,PCR及酶切筛选得到重组腺病毒质粒,将重组腺病毒质粒转染Hep-2细胞进行包装,获得感染性的重组腺病毒粒子,免疫组化分析重组腺病毒中诺如病毒衣壳蛋白的表达.结果 同源重组后经酶切和PCR鉴定证明插入Noro-orf2基因的重组腺病毒质粒pBRAdv3E3dNor成功构建,并经转染包装得到高滴度的重组腺病毒Adv3E3dNor,免疫组化证明诺如病毒衣壳蛋白得到表达.结论 成功构建表达诺如病毒衣壳蛋白的重组3型腺病毒Adv3E3dNor,为研制人3型腺病毒-诺如病毒双价疫苗奠定了基础.