生长抑制因子1基因核定位序列-绿荧光蛋白融合表达载体的构建及表达

目的构建p33^ING1b核定位序列（nuclear locating sequence，NLS）-绿荧光蛋白融合表达载体，将其转染到人胚肺纤维母细胞系MRC-5，建立稳定表达该融合蛋白的细胞模型。方法应用逆转录PCR获得p33^ING1b的NLS序列，然后将NLS序列插入绿荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1的多克隆位点，构建pEGFP-C1-NLS-绿荧光蛋白融合表达载体，再用此载体转染MRC-5细胞系，观察活细胞绿荧光蛋白的亚细胞定位。结果成功构建了pEGFP-C1-NLS-绿荧光蛋白融合表达载体，由该载体表达的绿荧光蛋白-NLS肽段融合蛋白产生的绿色荧光信号全部定位于胞核部位，而空载体转染的细胞表达的绿色荧光蛋白，绿色荧光信号定位于细胞浆中。结论在活细胞内，生理情况下p33^ING1b完全定位于细胞核，并且在其亚细胞定位的转运过程中，NLS肽段起着决定性作用。     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

诱导型一氧化氮合酶在精索静脉曲张大鼠睾丸中的表达

目的：探讨精索静脉曲张大鼠睾丸组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达与不育的关系。方法：选择30只成年SD大鼠,随机分为精索静脉曲张组20只,假手术组10只,应用免疫组织化学EnVision法检测iNOS在睾丸组织中的表达并测量曲细精管的直径,比较两者之间差异。结果：精索静脉iNOS的表达明显高于假手术组,差异有非常显著性意义,曲张组曲细精管的直径明显小于假手术组,差异有非常显著性意义。结论：精索静脉曲张大鼠睾丸组织中iNOS过度表达是导致不育的原因之一。     

腹腔镜对102例女性不孕症诊治的评价分析

目的探讨腹腔镜检查术对女性不孕症的诊治价值。方法回顾性分析腹腔镜检查的102例女性不孕症患者（术后随访2年）,对腹腔镜诊治的结果进行评价。结果镜下诊断盆腔各种病变101例（99.02%）,未发现异常1例（0.08%）。其中输卵管因素54例,子宫内膜异位症34例,卵巢异常8例,子宫异常5例,其他1例。术后随访2年,其妊娠率分别为：输卵管异常31.50%（17/54）,子宫内膜异位症38.24%（13/34）,卵巢异常12.5%（1/8）。结论输卵管因素和子宫内膜异位症是导致女性不孕的主要因素。腹腔镜对诊治输卵管性不孕和子宫内膜异位症,具有快速,准确,可靠,损伤小的特点。     

糖皮质激素对甲醛致炎大鼠c-fos表达的影响

目的为糖皮质激素(GCS)对神经细胞的作用提供形态学资料。方法30只SD大鼠随机分为:对照组、单纯甲醛组、地塞米松预处理组、RU486预处理组、RU486+地塞米松预处理组,甲醛刺激后采用动物行为学方法、免疫组织化学法、神经细胞染色和形态计量学方法进行观察。结果在大鼠后爪掌面皮下注射稀释甲醛20μl可造成注射处急性持续性炎症。1h后,同侧脊髓腰膨大背角浅层。双侧中缝大核、丘脑、大脑皮层Fos免疫阳性神经元(FLI)总数明显上升,对侧脊髓内少量散在分布。用地塞米松预处理2h后可使相应部位FLI神经元数明显降低,具有剂量依赖性。外周水肿。疼痛表现与同侧背角浅层FLI细胞数呈正相关。用糖皮质激素受体阻断剂RU486可部分反转GCS的效应。结论伤害性刺激可引起中枢神经系统c-fos广泛表达。GCS可降低脊髓后角神经元的兴奋性。     

不同浓度的臭氧对实验兔骨骼肌病理学的影响

目的 观察两种浓度的臭氧(03)对实验兔骨骼肌组织的病理变化的影响,以评估臭氧对肌纤维的氧化程度.方法 10只实验兔随机分为A、B两组.随机选择一侧大腿肌肉注射臭氧-氧气混合气体,A组为浓度50μg/ml,B组为浓度30μg/ml两组分别注射5 ml气体.注射臭氧后0.5、2 h和2周后分别对臭氧注射点、旁开1 cm和2 cm取活检组织行病理学光镜检查,对侧大腿相对应部位取活检作空白对照.结果 与空白对照组比较,病理光镜下显示A、B两组注射臭氧后0.5 h注射点、旁开1 cm见肌细胞肿胀,间隙变窄或不清,肌细胞边界不清,横纹紊乱,部分肌细胞坏死溶解,空泡变性;2 h后注射点、旁开1 cm处在肌细胞坏死溶解的基础上出现了肌细胞间隙和血管内炎症细胞浸润;2周后注射点、旁开1 cm切片显示肌细胞明显萎缩,大量纤维组织增生,部分伴有玻璃样变.上述3个时点的注射点旁开2 cm病理切片均未见异常.结论 两种浓度的臭氧肌肉注射后会产生程度相当的肌细胞损害,范围半径约2 cm,可能对炎性肌细胞或肌纤维化组织起治疗作用,2周后纤维组织损伤修复.     

CD3AK细胞过继免疫治疗的实验研究

目的: 分析抗CD3分子的单克隆抗体 (mAb)yCD3的免疫学特性和生物学活性, 观察其激活的免疫活性细胞CD3AK体外及动物体内的抑瘤作用。方法: 用流式细胞术(FCM)测定yCD3的特异性, 以及CD3AK细胞的免疫表型和产生细胞因子的情况。用 3H -TdR法测定yCD3对淋巴细胞转化的作用; 乳酸脱氢酶法 (LDH)测定CD3AK细胞的体外细胞毒活性。建立荷瘤小鼠模型, 观察静脉注射CD3AK细胞后肿瘤生长的情况、转移灶数量和小鼠存活天数。结果: yCD3与T细胞呈特异性反应, 5μgyCD3可竞争抑制 70%的标准抗CD3抗体与细胞表面CD3分子的结合。yCD3刺激外周血淋巴细胞增殖的有效浓度为 8μg/L, 并与IL- 2、抗CD28抗体有协同作用。活化的CD3AK细胞中CD3 、CD8 和CD25 细胞增多; 产生IL- 2和IFN γ的CD3 细胞均有不同程度的增加, 在抗CD28抗体协同刺激下分别增加 3. 29和 2. 47倍。当效靶细胞比为 80∶1时, CD3AK细胞对体外肿瘤细胞杀伤的百分率为 57. 54%。分组观察荷瘤动物, CD3AK细胞治疗组的抑瘤率为 33. 17%, 对小鼠肿瘤肺转移的抑制率为39. 70%, 与LAK细胞联合治疗的疗效更显著。结论: yCD3可活化T细胞, 诱导的CD3AK细胞在体外及动物体内显示抑制肿瘤的作用, 在临床抗肿瘤过继性免疫治疗中具有重要意义。     

鼠疫F1-V重组蛋白疫苗滴鼻免疫应答效果的研究

目的 以重组霍乱毒素B亚单位（rCT-B）为鼠疫F1-V重组蛋白的佐剂制备黏膜疫苗，观察小鼠诱导的黏膜免疫和系统免疫应答效果。方法以制备的鼠疫黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠4次免疫后，采用间接ELISA检测血清特异性抗F1-V的IgG和IgA抗体及抗体亚型分类，检测鼻咽喉、肺、小肠及阴道灌洗液中特异性抗F1-V的黏膜分泌型IgA；采用流式细胞术检测鼻相关淋巴组织淋巴细胞、脾淋巴细胞、肠系膜淋巴结及小肠PP结T淋巴细胞表型的变化。结果以rCT-B为佐剂的鼠疫F1-V重组蛋白黏膜疫苗滴鼻免疫后，能够诱导血清中IgG、IgA抗体比正常对照组显著升高（P〈0．01），同时诱导鼻咽、肺、小肠和阴道内特异性黏膜抗体升高，尤其是肺和生殖道冲冼液内抗体升高极为显著（P〈0．01）。与单纯的F1-V组相比，不同剂量比例疫苗组都能诱导较高、较快的血清IgG、IgA和黏膜sIgA，其中1：2疫苗组能诱导更强的系统免疫和黏膜免疫，但是相比之下，5：1疫苗组是最合适的免疫剂量。结论rCT-B佐剂不仅能提高鼠疫F1-V黏膜疫苗的系统全身免疫应答，还能促进诱导呼吸道、消化道和生殖道等局部黏膜sIgA抗体，增强局部免疫应答，提示rCT-B佐剂能显著提高鼠疫感染的免疫应答作用，这为下一步疫苗的免疫保护评价奠定了基础。     

一株抗人BLys单克隆抗体的制备及其生物学功能研究

研究以稳定高表达BLys的基因转染细胞L-BLys为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,L-BLys细胞和天然表达BLys的HL60细胞为抗体筛选阳性细胞株,经免疫荧光标记分析反复筛选和以有限稀释法反复克隆化培养。将获得的克隆4F7培养细胞注射入经致敏的小鼠体内,-抽取的腹水经Protein G亲和层析柱纯化。将纯化所得的抗体作用于经BLys分子刺激的扁桃体B细胞,3H-TdR检测细胞的增殖效率。结果获得1株持续、稳定分泌鼠抗人BLys单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该细胞株所分泌的抗体能阻断膜型和可溶性BLys分子对扁桃体B细胞的促增殖作用。对这株单克隆抗体生物学功能的研究表明,这株单抗能特异性识别人BLys分子及阻断膜型和可溶性BLys发挥生物学活性。     

新型mucA基因突变的铜绿假单胞菌生物被膜的形成和藻酸盐相关基因表达的研究

目的 确定黏液型铜绿假单胞菌PA17的mum基因突变位点，研究藻酸盐合成相关基因在其生物被膜形成过程中的表达，并观察PAl7生物被膜形成过程和形态。方法 PCR方法扩增铜绿假单胞菌PA17的mueA基因全长并测序；改良平板培养法建立PA17的生物被膜模型，半定量RT-PCR测定生物被膜形成24h、3d．6d时藻酸盐合成相关基因,algD、algU和algR的表达，并进行统计学分析；扫描电镜观察不同时间点的生物被膜形态。结果 PA17的mucA基因第166～333位核苷酸片段缺失，第342位A→G；其藻酸盐相关基因algD和algU均在生物被膜形成过程的第6天表达水平最高，algR在24h表达最高，单因素方差分析显示，上述基因在生物被膜形成过程不同时间点表达的差异有统计学意义；PA17于第6天形成成熟生物被膜，形态为薄膜状。结论 PA17是一株含新型mucA突变基因的黏液型铜绿假单胞菌，其藻酸盐相关基因在生物被膜形成的不同时间点的表达差异具有统计学意义，其生物被膜形态为薄膜状。