甘草断面颜色与其有效成分的相关性分析

目的：研究几种中药有效成分与CASP3靶点的相互作用,分析其作用机理及结构特征,为CASP3抑制剂的开发提供参考。方法：基于前期研究,本文选择几种天然产物的有效成分,采用分子对接和分子动力学方法模拟其与CASP3靶点之间的相互作用,通过作用力分析配体和靶点的作用机制。结果：筛选出的丹参酮IIA和野黄芩苷与CASP3靶点的结合能力较强,通过分子动力学方法分别获取了丹参酮IIA和野黄芩苷与CASP3结合的理论稳定结构。丹参酮IIA与CASP3中的Phe256、Ser205、Trp206等4个氨基酸残基具有疏水作用,形成1个氢键。野黄芩苷与CASP3靶点中的Ser249、Trp214、Trp206等9个氨基酸残基具有疏水作用,形成了7个稳定性不同的氢键,其中静电相互作用是其结合更为稳定的主要原因。结论：丹参酮IIA和野黄芩苷能与CASP3靶点形成较为稳定的结合结构,探索相似的结构有利于设计更有效的CASP3抑制剂。     

噪声对小鼠耳蜗外侧壁缝隙连接蛋白Connexin31表达的影响

目的观察噪声性聋小鼠耳蜗外侧壁缝隙连接蛋白Connexin31(Cx31)表达的变化。方法选用成年雄性Balb/c小鼠44只,随机分为噪声组和对照组,每组22只。两组小鼠均在实验前检测听性脑干反应(ABR),随后应用声刺激器给予噪声组小鼠高强度白噪声(115dB SPL,6h/d,共2天),并在噪声暴露结束后1h再检测噪声组小鼠ABR。对照组不予噪声刺激。于噪声暴露后4h,每组各取4只小鼠耳蜗做冰冻切片,其余18只小鼠提取耳蜗外侧壁组织总RNA,通过免疫荧光染色法观察小鼠耳蜗外侧壁Cx31蛋白的表达,荧光实时定量PCR检测小鼠耳蜗外侧壁Cx31mRNA的表达。结果对照组小鼠耳蜗螺旋韧带可见Cx31特异性荧光,血管纹处未见阳性荧光;噪声组小鼠耳蜗外侧壁免疫荧光染色阳性反应较对照组减弱,Cx31mRNA表达量明显低于对照组。结论噪声能下调Cx31在小鼠耳蜗外侧壁组织的表达,Cx31可能参与了噪声性聋的发病机制。     

噪声对豚鼠耳蜗血管纹紧密连接蛋白claudin-5表达及血迷路屏障通透性的影响

目的研究噪声对豚鼠耳蜗血管纹紧密连接蛋白claudin-5表达及血迷路屏障功能的影响。方法40只豚鼠随机分为正常对照组(20只)和噪声暴露组(20只),噪声暴露组给予声强为115dB SPL白噪声暴露,每天6小时,连续两天,对照组不予噪声暴露。于实验前及噪声暴露后次日对两组豚鼠行ABR检测,第二次ABR检测后对两组豚鼠耳蜗基底膜行鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素(Phalloidin-FITC)染色;用硝酸镧透射电镜和常规透射电镜观察两组豚鼠内耳血迷路屏障通透性和紧密连接的变化;Western blot和免疫组织化学染色观察两组豚鼠耳蜗血管纹和螺旋韧带处claudin-5的表达。结果噪声暴露组豚鼠ABR波Ⅲ反应阈较正常对照组阈移40dB以上,差异有统计学意义(P<0.05);基底膜铺片FITC染色示噪声暴露组底回基底膜毛细胞大量缺失,其余部分毛细胞纤毛排列紊乱并出现融合,而对照组毛细胞排列整齐,其纤毛呈V或W型,两组间外毛细胞计数比较差异有统计学意义(P<0.05);透射电镜下,可见噪声暴露组血管内皮细胞间和边缘细胞间的紧密连接均遭到破坏,细胞间隙增大;硝酸镧透射电镜下,大量镧颗粒从血管腔内渗漏到管腔外的组织间隙,而对照组镧颗粒仅局限于血管腔内;Western blot结果示,两组耳蜗外侧壁血管纹均有claudin-5表达,但噪声暴露组的表达量明显低于正常组;免疫组织化学染色也表明,两组豚鼠耳蜗外侧壁毛细血管内皮细胞、边缘细胞等处均有claudin-5阳性表达,但噪声组表达量显著低于正常组(P<0.05)。结论噪声通过下调紧密连接蛋白claudin-5的表达,破坏细胞间紧密连接,增加豚鼠血迷路屏障的通透性,从而导致内耳微环境的破坏,是噪声性聋可能的发病机制之一。     

树突状细胞参与中耳炎内耳免疫反应的实验研究

目的探讨树突状细胞(DCs)是否及通过何种途径参与内耳的免疫应答,分析中耳炎免疫引发的内耳免疫对内耳功能的影响。方法将Hoechst33342标记的DCs分别经由脑脊液,颈外静脉及颈部皮下注入豚鼠体内,并在无菌条件下于右耳经鼓膜注射1×108L-1的金葡菌液100μL,左耳作正常对照,造急性中耳炎豚鼠模型。3天后基底膜切片及铺片若单明-鬼笔环肽(Phalloidin)染色,荧光显微镜(Olympus)及共聚焦显微镜观察。结果三种途径注入的DCs均可以在中耳炎豚鼠的中耳粘膜发现。在豚鼠内耳前庭阶、鼓阶内可以发现大量的免疫细胞渗入,同时可见DC位于内耳,数目很少,分布于基底膜、血管纹、螺旋神经节及壶腹嵴。三组动物对照耳仅皮下注射组有一例在耳蜗发现DCs渗入。器官切片除脑脊液组在脑中发现DC外,其余均未见DCs渗入。结论 DCs可以通过不同途径参与中耳炎所致的内耳免疫反应。作为最强的抗原提呈细胞,免疫反应的启动者,DCs在内耳诱导强烈的免疫反应,这种免疫反应可能对内耳的结构和功能产生不可逆的严重损伤,DCs功能紊乱可能为自身免疫性内耳疾病的原因之一。提示抑制过度免疫反应能够有效保护内耳的免疫损伤。     

建立大鼠骨髓源性树突状细胞体外扩增及纯化的方法

目的:目前对树突状细胞的研究主要集中在人及小鼠系统,关于大鼠树突状细胞特性和功能的研究较少。体外扩增并纯化大鼠骨髓树突状细胞的方法,并对其进行形态学和免疫学鉴定。方法:实验于2004-06/2005-06在第四军医大学西京医院耳鼻喉科实验室完成。实验材料:8～12周龄雌性SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。实验方法:①参考Oliver方法,利用黏附法诱导分离SD大鼠骨髓细胞,获得高纯度的树突状细胞。采用扫描电镜和透射电镜观察培养6,8,10,12 d与12 d加内毒素情况下细胞形态,并采用流式细胞仪鉴定。②无菌条件下取出大鼠脾脏加RPMI1640培养液研磨并通过不锈钢筛网,收集未贴壁细胞,以RPMI1640培养液冲洗出的细胞作为反应细胞。取96孔培养板加入反应细胞,并按照1∶480,1∶240,1∶120,1∶60比例加入刺激细胞。采用ELX800型酶联免疫检测仪测定波长为490 nm处吸光度值。结果:①随培养时间的增长,细胞逐渐成熟,培养12 d的细胞形态不规则,表面有大量树突状突起,培养12 d加内毒素的细胞进一步成熟,体积增大,高表达CD80、CD86分子。②随着培养时间和树突状细胞数目的增加,树突状细胞刺激T细胞增殖的能力逐渐增强,加入内毒素后这种能力进一步加强。结论:成功地建立了体外大量扩增大鼠骨髓树突状细胞方法,并可在培养过程中收获不同成熟状态树突状细胞。     

大鼠嗅球神经干细胞培养

目的　建立大鼠嗅球神经干细胞 (neuralstemcells,NSC)体外培养方法 ,研究其增殖和分化特性。方法　采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养新生第 1天和成年大鼠嗅球NSC ,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSC及自然分化为特异性神经细胞的类型 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定嗅球NSC的生长曲线。结果　从生后第 1天和成年大鼠嗅球分离、培养出表达巢蛋白(nestin) ,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSC。生后第 1天和成年大鼠嗅球的神经球形成率分别为 2 0 %～ 30 %和 0 1%。嗅球NSC的增殖依赖表皮生长因子 (epidermalgrowthfactor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子 (fibroblastgrowthfactor basic,bFGF) ,其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF。结论　从生后第 1天和成年大鼠嗅球可以培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSC。     

大鼠嗅球神经干细胞的超微结构

目的研究体外培养的大鼠嗅球神经干细胞(neuralstemcell,NSC)的超微结构。方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养出生后第1天大鼠嗅球NSC,分别于培养后1周,1个月及2个月收集NSC,2.5%戊二醛固定,行扫描电镜及透射电镜观察。结果体外培养的NSC呈圆形或椭圆形,表面有微突起或微绒毛,细胞核浆比例高,稀少的细胞浆中有多少不等的未成熟线粒体、核糖体及高尔基复合体。不同培养时期的神经球内未分化NSC的结构大致相同,均有分裂增殖细胞及少数凋亡细胞。培养1～2个月后出现存在粗面内质网及粗长突起的分化细胞。相邻分化细胞的突起间有缝隙连接。结论体外培养的大鼠嗅球NSC保持原始细胞的形态和结构,并能分化成神经细胞。     

大鼠嗅上皮神经干细胞培养及鉴定

胚胎及成年神经干细胞(neural stem cell，NSC)的成功培养为中枢神经系统疾病治疗带来了新的策略。从颅外组织如嗅上皮获取：NSC可能是自体NSC移植的理想途径。研究表明，成年人及小鼠的嗅上皮中含有NSC。本研究观察新生及成年大鼠嗅上皮NSC的增殖及分化特性，为嗅上皮NSC的进一步研究提供参考。     

c-myc在大鼠耳蜗组织发育和耳蜗前体细胞分化过程中的表达变化

目的 通过检测c-myc基因在大鼠耳蜗组织发育及前体细胞分化过程中的表达情况,探讨其在哺乳动物耳蜗发育中的作用.方法 ①取E10、E15、P1、P7和P14的SD大鼠耳蜗组织,应用RT-PCR、Western blot的方法检测c-myc在大鼠耳蜗组织发育过程中的表达情况.②取耳蜗前体细胞和分化7天后的分化细胞,用RT-PCR、免疫细胞化学染色和Western blot的方法检测c-myc在耳蜗前体细胞分化过程中的表达情况.结果 从胚胎至出生后的耳蜗发育过程中,c-myc表达量呈现逐渐下降趋势;在前体细胞的分化过程中,c-myc的表达量也呈现下降趋势.结论 c-myc可能参与调控大鼠耳蜗组织的发育及前体细胞的分化.