四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

目的：构建调控β-半乳糖苷酶（β-gal）基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法：根据2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因（TR）的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4 d后,给予强力霉素（4 mg•L^-1）,利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果：构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论：成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。     

结肠癌细胞总RNA电穿孔法体外转染成熟树突状细胞

目的：探讨结肠癌细胞总RNA电穿孔法转染成熟树突状细胞（mDCs）的转染效率及对树突状细胞(DCs）特征和功能的影响,为DCs核酸肿瘤疫苗的制备及其在临床应用奠定基础。方法： 用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素4（rhIL-4）将人外周血单核细胞(PBMC)诱导成未成熟树突状细胞（imDCs）,肿瘤细胞坏死因子-α（TNF-α）作用24 h刺激其成熟。实验设为imDCs组和mDCs组。Trizol法提取特异表达癌胚抗原(CEA)的结肠癌细胞SW480总RNA,电穿孔法将总RNA转染mDCs,设为RNA转染DCs组。流式细胞术检测各组细胞表面分子标志变化和转染DCs组的CEA蛋白表达情况。ELISA法检测各组细胞IL-12分泌水平。结果：rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α能将PBMC诱导成具有典型毛刺样突起形态学特征的DCs。imDCs组DCs表面CD1a表达呈阳性,CD80弱阳性,CD83阴性。mDCs组DCs表面CD1a、CD83、CD80表达均呈阳性。RNA转染DCs组DCs表面CD1a、CD83、CD80表达均呈阳性。总RNA转染mDCs后4 h检测到CEA蛋白表达。mDCs组、RNA转染DCs组IL-12分泌量与imDCs组比较均显著升高（P＜0.01), 而mDCs组与RNA转染DCs组比较差异无显著性（P>0.05)。结论：结肠癌细胞总RNA可通过电穿孔法转染mDCs并表达CEA蛋白,电穿孔不改变mDCs的表面分子特征及功能。     

人SLPI启动子调控下eGFP基因表达载体的构建与表达

目的构建SLPI基因启动子驱动下EGFP表达载体并验证该启动子在非小细胞肺癌细胞株中的特异调控活性。方法通过PCR方法从人外周血基因组中扩增SLPI启动子，经序列分析后，利用peDNA3．1（＋）和pEGFP构建SLPI启动子调控下EGFP表达载体，以脂质体介导转染入人宫颈上皮癌Hela、肺腺癌A549、SPC-A1和肝细胞癌HepG2细胞中，经G418稳定筛选后，在荧光显微镜下观察该启动子在非小细胞肺癌细胞株中的特异调控EGFP表达的活性。结果克隆出的SLPI启动子序列与Genebank上SLPI基因上游5’末端转录调控区的序列完全一致，稳定转染的细胞株Hela、A549、SPC—A1和HepG2中，CMV启动子控制下的EGFP基因均有表达，发出绿色荧光；而SLPI启动子词控下的EGFP基因在Hela、A549和SPC-A1中有表达，发出绿色荧光，在HepG2中则未见荧光发出。结论钓取的人SLPI启动子在非小细胞肺癌细胞中具有特异调控其下游基因表达的活性，为探索该启动子调控下的抗肺癌基因治疗提供实验基础。     

小剂量米索前列醇应用于足月妊娠引产50例临床分析

目的 探讨小剂量米索前列醇在足月妊娠引产中的有效性和安全性. 方法 选择有引产指征的单胎足月妊娠初产妇100例,随机分为2组:米索前列醇组50例,予25μg米索前列醇置于阴道后穹窿,6h无临产可重复同剂量用药,24 h内总量不超过50 μg;缩宫素组50例,予常规5 U/L缩宫素静滴. 结果 米索前列醇组引产有效率高于缩宫素组(96％ vs.76％,P＜0.01),且最后一次用药至临产时间为(5.48±2.44)h、分娩总产程时间为(5.59±2.56)h,分别短于缩宫素组的(8.26±6.75)h和(8.65 ±7.34)h(P ＜0.05),剖宫产率低于缩宫素组(4％ vs.36％,P＜0.01),急产率高于缩宫素组(22％ vs.2％,P＜0.01);而产后出血率、新生儿窒息率两组比较均无统计学差异(P＞0.05).结论 小剂量米索前列醇用于足月妊娠引产安全、经济、有效、方便,更值得在基层医院临床推广.     

阿伐他汀和罗格列酮对HepG2肝细胞的耗糖作用比较

将胰岛素、阿伐他汀和罗格列酮分别作用于HepG2细胞,24、48 h后取上清进行葡萄糖吸光度检测和四甲基偶氮唑盐试验（MTT）。结果48 h阿伐他汀加胰岛素组葡萄糖吸光度、MTT吸光度与胰岛素组比较均明显下降（P均〈0.05）。表明阿伐他汀在体外对HepG2细胞有促进葡萄糖摄取和抑制细胞增生的毒性作用,而罗列酮在体外对HepG2细胞无促进摄糖作用,但具有一定的肝毒性。     

葛胺酮对在体和离体动物脑动脉舒张作用的研究

目的研究葛胺酮对在体和离体动物脑动脉的舒张作用。方法在体实验采用激光多普勒血流仪,连续动态观察葛胺酮对正常大鼠脑血流灌注压、血压(收缩压、舒张压、平均动脉压)、心率、心电图指标的的影响。体外实验采用分离犬基底动脉条,分别以重酒石酸去甲肾上腺素(5 mg·L-1),KCl(3 mol·L-1),5-羟色胺(3.3 mg·L-1)收缩效应的百分率作为评价抑制强度的指标,研究葛胺酮对基底动脉的舒张作用强度及特点。结果在体实验观察到葛胺酮25、50、100 mg·kg-1对大鼠脑血流量灌注压均有增加作用,100 mg·kg-1组比给药前脑血流增加了2～3倍。葛胺酮在增加脑血流量的同时对收缩压、舒张压均有短暂的降压作用,舒张压下降幅度大于收缩压,平均血压下降了10～40 mmHg。体外实验发现葛胺酮0.01、0.1 mg·ml-1对重酒石酸去甲肾上腺素、KCl、5-羟色胺诱导的犬基底动脉收缩均有明显的抑制作用,其舒张率达21%～99%。结论葛胺酮具有增加脑血流量同时降低血压的作用,优于葛根素。其增加脑血流量的作用与其舒张动脉的作用有关。葛胺酮可能是一个多靶点的血管紧张抑制剂,对脑缺血可能具有一定的保护作用,值得进一步研究。     

家蚕素Ⅱ基因真核表达载体的构建

目的构建（BbxⅡ）基因真核表达载体,为研究家蚕素Ⅱ在哺乳动物细胞中的生物学作用奠定基础。方法以含有BbxⅡcDNA的PUC57质粒为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增BbxⅡcDNA片段。真核表达载体PcD-NA3.1及PCR产物经双酶切后连接,转化大肠杆菌DH-5α感受态菌,获得重组载体PcDNA3.1-Bbx/His,进行酶切鉴定和测序鉴定。结果 PCR获得与预期大小一致约300 bp的特异性DNA,重组载体PcDNA3.1-BbxⅡ/His经双酶切及测序鉴定证实,BbxⅡ基因的cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论成功构建含有家蚕素基因Ⅱ的真核表达载体。     

硝苯地平对氯化钾、去甲肾上腺素及内皮素诱导离体大鼠血管收缩的影响

目的观察硝苯地平对KCl、去甲肾上腺素(NE)、内皮素(ET-1)诱导离体大鼠主动脉血管收缩的影响,并探讨其作用机制。方法以KCl、NE、ET-1在含钙离子和不含钙离子的K-H液中预收缩离体大鼠主动脉环,并观察硝苯地平的收缩血管作用。结果在含钙离子K-H液中,硝苯地平对KCl、NE、ET-1引起的离体大鼠血管收缩作用的半数有效剂量EC50分别为0.072、5.34、0.15μmol/L;在无钙离子K-H液中,硝苯地平对离体大鼠未产生收缩血管作用。结论硝苯地平的扩血管作用与其选择性阻断电压依赖性钙通道有关。