四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

目的：构建调控β-半乳糖苷酶（β-gal）基因表达的四环素基因表达调控载体，验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达，为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法：根据2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列，设计引物，以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游，构建成pcDNA3.1-TetO2载体，应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体，构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因（TR）的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中，利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中，转染3～4 d后，给予强力霉素（4 mg•L^-1），利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色，检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果：构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明，串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明，β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示，TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后，β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达；而未给予强力霉素，β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论：成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体，利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。