幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及序列分析

目的：结一株临床分离的高粘附力幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ）菌株进行会素基因ｈｐａＡ的序列分析,为研究Ｈｐ的粘附提供分子基因。方法;设计ｈｐａＡ的特异引物,交去物插入ｐＵＣ１９载体要建ｈｐａＡ的重组克隆,ＤＮＡ自动分析仪进行序列测定,ＣｌｕｓｔａｌＸ和Ｈｏｍｏｌｏｇｙ软件分析ＤＮＡ及其推导出的基酸序列。结果：构建了粘附素ＨｐａＡ的重组质粒ｐＵＣｈｐａ,测充显示ｈｐａＡ结     

CagA与幽门螺杆菌致病的相关性研究

本调查了114胃镜受检的Hp感染率，应用血清ELISA技术检测了Hp菌株中CagA闭性数，并对该蛋白与慢性胃病的关系进行了初步分析。结果发现54例中Hp阳性，CagA阳性25例，阳性率46.3%；胃炎、十二指肠溃疡和胃癌组织CagA阳性率分别为27.3%，71.4%和85.7%（P<0.01）。CagA阳性菌株感染胃粘膜的炎症程度、活动度及萎缩、肠化与淋巴滤泡形成数均高于阴性，证实了CagA在Hp致病中的重要作用。     

幽门螺杆菌感染与胃不同部位组织学病变的关系

目的 明确幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H,pylori)感染与胃不同部位粘膜组织学病变的关系。方法 在215例胃镜受检者胃窦、角、体三点取材进行组织学检查，Giemsa染色明确H.pylori感染情况，HE染色计量观察组织学病变情况，分析两者的相关关系。结果 从胃窦到胃角、胃体，炎症程度(单个核细胞浸润)、活动度(中性粒细胞浸润)、糜烂及淋巴滤泡形成均递减，H.pylori阳性者积分高于阴性者。在胃窦和胃角部，H.pylori感染更常引起近腔面上皮分泌下降，而在胃体部无此发现，H.pylori感染在三个部位均可引起腺体萎缩。结论 H.pylori感染是胃多部位组织学病变如淋巴细胞、中性粒细胞浸润、糜烂和淋巴滤泡形成与粘膜萎缩的病因，在胃窦和胃角引起的病变重于胃体。     

肥大细胞脱颗粒在幽门螺杆菌致病中的作用

目的 研究肥大细胞（MC）在幽门螺杆菌（H pylori)发病中的作用。方法 选胃镜检查者87例，其中诊断十二指肠溃疡（DU）33例，浅表性胃炎45例，糜烂性胃炎9例。取胃窦、体部活检分别作组织病理学（HE染色）及H pylori检查（快速尿素酶、培养及Warthin-Starry银染），免疫组织化学染色（ABC法）后分别计算粘膜及粘膜下的完整和脱颗粒MC数。结果 MC计数在H pylori阳性和H pylori阴性组间无明显差别（P＞0．05），但前者粘膜内MC脱颗粒者明显多于后者（分别为43％和23％，P＜0．01）。MC计数与粘膜炎症程度无明显关系，但在活动性炎症时显著高于非活动性炎症组（P＜0．05）。各病变组间MC计数也无显著差异。结论 MC可能在粘膜H pylori相关炎症的发生发展中起着重要作用。     

Smac/DIABLO过表达对人结肠癌细胞凋亡的影响

Smac／DIABLO是一种线粒体促凋亡蛋白，研究表明其在结肠癌细胞中表达降低。目的：研究Smac／DIABLO对人结肠癌细胞生长的影响及其可能的促凋亡机制。方法：将pcDNA3.1-Smac质粒或pcDNA3.1空质粒以脂质体转染人人结肠癌细胞株LoVo,以未转染细胞作为空白对照。以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Smac mRNA表达，蛋白质印迹法检测Smac蛋白表达，Hoechst33258染色观察凋亡细胞核形态学变化，Annexin V-FITC／PI双染流式细胞仪分析检测细胞凋亡率,PI染色流式细胞仪分析检测细胞周期。Caspase-3分光光度法检测试剂盒检测Caspase-3活性。结果：pcDNA3.1-Smac质粒转染12h后，kVo细胞Smac mRNA表达增加；转染48h后，Smac蛋白表达增加。转染48h后,Smac组LoVo细胞呈现明显凋亡细胞核形态学特征。凋亡率显著高于hVo细胞组和空质粒组，GO／G1期细胞增多,Caspase-3活性亦显著高于空质粒组（P〈0．05）。结论：Smac／DIABLO可激活caspase-3途径，抑制人结肠癌细胞生长,促进细胞凋亡。使细胞周期阻滞于G0／G1期。     

幽门螺杆菌过氧化氢酶脂质体疫苗免疫预防研究

目的探讨制备脂质体包裹重组幽门螺杆菌过氧化氢酶(Kat)口服疫苗的方法,并用Hp感染的小鼠模型评价其在预防Hp感染中的作用。方法将PET-22(+)/Kat在BL21(DE3)大肠杆菌表达,表达Kat的包涵体经洗涤、变性、复性,采用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶过滤层析分离纯化Kat重组蛋白,用薄膜分散法制备以卵磷脂和胆固醇为膜组分包裹的Kat重组蛋白口服疫苗,并用透射电镜测定其粒径。BALB/c小鼠分为5组,分别通过灌胃方法给予PBS、空白脂质体、Kat重组蛋白+CT、脂质体包裹Kat重组蛋白、脂质体包裹Kat重组蛋白和CT,每周1次共4次,末次攻击2周再用活Hp攻击3次,3周后处死小鼠,行胃组织快速尿素酶试验、Hp的定植半定量、炎症程度及其炎症活动度的评分。结果以包涵体为主的表达产物占全菌总蛋白的24.4%,经纯化获得纯度为95%的重组蛋白,制备的脂质体粒径为0.7±0.4μm。PBS组和空白脂质体组保护率均为0,而Kat重组蛋白+CT组、脂质体包裹Kat重组蛋白组、脂质体包裹Kat重组蛋白和CT组的保护率分别为73.3%、66.7%和86.7%,且均能使免疫小鼠胃粘膜Hp感染数目明显减少,炎症反应减轻。结论口服脂质体部能分代替免疫佐剂的作用,将其作为Hp疫苗的免疫佐剂,具有广泛的应用前景。     

幽门螺杆菌粘附素保守区蛋白的制备及其免疫原性、安全性和粘附作用的体外评价

目的通过基因工程技术制备幽门螺杆菌(Hp)保守区(AB)蛋白,并在体外探讨其安全性、免疫原性和黏附作用,以确定AB在卸疫苗研制中的应用价值.方法运用PCR技术从Hp总DNA中扩增出AB结构基因.装入pET-22b(+)载体进行序列及生物信息学分析,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用金属螯合亲和层析(MCAC)的方法纯化AB,免疫印迹法检测其抗原性;流式细胞术检测AB致T细胞表达FasL的作用,ELISA法测定Hp感染者血清中抗AB抗体,MTT法测定T细胞对AB的增殖反应,光镜计数法研究AB抗体对Hp与胃癌细胞粘附的影响.结果成功构建了AB的重组质粒pET-22b(+)/AB,序列分析显示获得了段588 bp的基因,完整的包含了粘附素C-端的7个保守区,Parker法和Welling法分析显示AB具有良好的抗原性。进一步应用INTERNETExPASY、NNPREDICT、ISREC等生物信息软件分析,发现其为膜孔素样结构,是跨膜区膜外区域的重要表位组成部分。在Genebank中BLAST分析了836767个蛋白序列,与其具有同源性者均为厅声外膜蛋白序列。蛋白电泳分析和凝胶扫描表明获得了高效表达AB的克隆株,其分子量为22.5kD,占菌体总蛋白的29.6％,其中可溶性表达占上清的21.9％,纯化后获得纯度达90％的重组蛋白AB,免疫印迹显示该蛋白可被AlpA兔抗血清抗体识别;体外安全性实验表明AB无明显调节T细胞表达FasL的作用;ELISA法共检测了55份血清,同时以RUT作为平行对照,两法的评价判断一致性程度的指标卡帕系数为0.76.同时,低剂量AB即可刺激Hp+PBL的增殖:AB抗血清能部分阻断Hp与胃癌细胞系的粘附,在光镜下表现为经抗AB兔血清预处理后,每细胞周围粘附的细菌数较免疫前兔血清预处理组显著减少(p<0.05).结论获得HeAB的基因工程蛋白产物,为Hp疫苗研制提供了一种新抗原,生物信息学分析显示其为良好的抗原成分;体外实验证实AB是安全的、具有免疫原性的Hp菌体成分,既可以刺激体液免疫,又能够提高细胞免疫,并已其抗体还可防止Hp与胃上皮细胞的粘附。     

幽门螺杆菌粘附素基因alpA的克隆与高效表达

目的 克隆并表达幽门螺杆菌粘附素AlpA基因。方法 提取幽门螺杆菌染色体基因，用PCR方法扩增alpA基因，将其克隆至表达载体pET-22B( ),转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达。结果 分离得到了1.5kb的alpA基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达，在37℃诱导表达3h后，表达产物占细菌总蛋白的31．9％。表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在，其中主要是包涵体的形式，目的蛋白占不溶性蛋白的64．8％。结论 幽门螺杆菌alpA基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础。     

房水的宽光大角度检查法

在临床上发现房水混浊对葡萄膜炎症的诊断有重要意义。目前检查房水有无混浊一般采用斑点状光束(spot-beam)或圆柱状光束(cylindric beam)照射房水,看其有无闪光现象(即Tyndall氏征)。作者于1962年某日夜间检查一名因角膜浅层异物合并虹膜睫状体炎的患者时,偶而使用较宽光束和较