肠出血性大肠埃希菌O157 ∶ H7质粒 pO157 上毒力因子的研究进展

肠出血性大肠埃希菌O157 ∶ H7是一种重要的致病菌,可以引起不同程度人类疾病。目前已知的O157 ∶ H7的致病因子有3个,志贺毒素、粘附抹平效应毒力岛和特异性质粒pO157。其中pO157在致病过程中的作用并不十分清楚。本文结合近年来的研究进展,介绍了pO157上与细菌致病性有关的毒力因子。     

几种肠道菌中细胞致死性肿胀毒素的检测及其细胞毒性初步研究

目的了解肠出血性大肠杆菌、非典型致泻性大肠杆菌、志贺菌及部分肠杆菌中CDT毒素基因存在情况及其细胞毒性。方法用PCR方法检测cdt基因,并将阳性菌株培养上清与HeLa细胞共同孵育检测细胞形态的改变,初步评价CDT毒素的表达及其细胞毒性。结果在肠出血性大肠杆菌O157∶NM中,cdt基因检出率为16.28%（7/43）,其中3株为cdt-Ⅲ型,其他4株为cdt-Ⅰ型;携带HPI毒力岛的非典型致泻性大肠杆菌中cdt基因检出率为6.25%（5/80）;在志贺菌中,cdt基因检出率为2.67%（4/150）,非典型致泻性大肠杆菌和志贺菌检出的cdt基因全部为cdt-Ⅰ型。而在O157∶H7大肠杆菌、枸橼酸杆菌和沙门菌未检出cdt基因。所有cdt基因阳性菌株均使HeLa细胞出现典型的细胞肿胀变化,效应滴度介于1∶2到1∶16之间。结论CDT毒素只在肠出血性大肠杆菌O157∶NM、携带HPI毒力岛的非典型致泻性大肠杆菌和志贺菌中检出,且检出率均比国外同类菌株低,其存在是否与疾病严重程度相关及其细胞毒性机制尚须进一步研究予以证明。     

优化与分析单核细胞增生李斯特菌的脉冲场凝胶电泳

目的 优化单核细胞增生李斯特菌(LM)脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法,分析菌株之间的相关性. 方法按照标准化的Lm-PFGE方法进行预实验,根据结果对实验方法进行一系列调整.分别用限制性内切酶Apal和Ascl酶对菌株进行酶切,通过脉冲场凝胶电泳获得电泳图谱,利用BioNumeries软件对图谱进行聚类分析. 结果优化后电泳图谱质量明显提高.22株LM被内切酶ApaI分为16种带型,被内切酶AseI分为17种PFGE型.两种酶分别将深圳的10株LM分为9种带型. 结论建立了高分辨力、稳定可靠的Lm-PFGE分型方法.深圳的LM属于多个克隆群的散发流行.     

2007年中国四省福氏志贺菌分离菌株的毒力基因检测和PFGE分析

目的分析中国河南等四省的福氏志贺菌分离菌株毒力基因和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型。方法应用PCR方法检测2007年从河南、青海、甘肃和山西分离的262株福氏志贺菌的侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、志贺肠毒素2基因(sen)、志贺肠毒素1基因(set1A)以及侵袭性蛋白基因(ipaBCD)。参考美国CDC的PulseNet实验方法 ,用限制性内切酶NotI对细菌染色体进行酶切,对这些分离菌株进行PFGE分析,使用BioNumerics软件进行聚类分析,并按照PulseNet命名原则对带型进行命名。结果 262株福氏志贺菌分离菌株ipaH、sen、set1A和ipaBCD基因的携带率分别为100%、93.89%、96.18%和92.75%。具有7种毒力基因携带模式,其中89.31%的菌株为Ⅰ型毒力基因携带模式(ipaH+sen+set1A+ipaB-CD+),有99.24%菌株同时携带两种或以上毒力基因。262株福氏志贺菌共分为83个PFGE型别,其中CNJZXN11.0002、CNJZXN11.0003、CNJZXN11.0060、CNJZXN11.0081、CNJZXN11.0137、CNJZXN11.0169、CNJZXN11.0190、CNJZXN11.0195、CNJZXN11.0196、CNJZXN11.0199、CNJZXN11.0217、CNJZXN11.0325和CNJZXN11.0327为13种主要带型。CNJZXN11.0003型菌株在4省均有分布,CNJZXN11.0199为河南菌株的优势带型,CNJZXN11.0137、CNJZXN11.0325和CNJZXN11.0327为山西特有的PFGE带型,与CNJZXN11.0003等主要带型聚类相似性较小。结论四省分离的福氏志贺菌株中ipaH、sen、set1A和iPaBCD毒力基因的携带率较高,而且这些菌株的PFGE型别既具有地区性差异,又具有优势型别的交叉。     

霍乱毒素B亚单位在乳酸乳球菌食品级表达系统中的分泌性表达

目的 在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)食品级分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ和L.lactis MBP71/pSQ中克隆表达霍乱毒素B亚单位(CTB),实现CTB的分泌性表达.方法 采用PCR扩增霍乱弧菌569B菌株染色体中CTB蛋白编码基因片段,克隆到食品级分泌表达载体pSQZ和pSQ中,转化入宿主菌L.lactis MBP71,构建CTB的分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB;采用Western-blot检测重组菌株中CTB的表达及表达量.结果 PCR扩增得到CTB编码基因片段ctB,酶切、连接到载体pSQZ和pSQ并转化到宿主菌L.lactis MBP71中,构建了分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB.Western-blot检测发现,L.lactis MBP71/pSQ-ctB和L.lactis MBP71/pSQZ-ctB系统均能分泌性表达CTB,L.lactis MBP71/pSQ-ctB上清的表达量约为2 μg/ml;L.lactis MBP71/pSQ-ctB的表达效率远远高于L.lactis MBP71/pSQZ-ctB.结论 成功实现了CTB在食品级表达系统中的分泌性表达.     

用16S rRNA基因克隆文库研究腹泻粪便中菌群分布

目的 建立16S rRNA基因克隆文库分析菌群的方法,用于临床标本菌群分布的检测.方法 临床标本直接提取核酸,用16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增、纯化、连接、克隆和测序,建立16s rRNA基因克隆文库,序列与数据库进行比对分析.结果 通过16S rRNA基因克隆文库分析,腹泻标本中检出4种细菌,脆弱拟杆菌为绝对优势菌,占91%;腹泻恢复后的粪便标本中菌群呈多样性,检出12种确定种属的细菌,其中脆弱拟杆菌占14%.结论 16S rRNA基因克隆文库是一种较好地研究粪便标本菌群的方法,可直接进行粪便标本的菌群分析和研究各种细菌在腹泻中的作用.     

单增李斯特菌1/2c血清型菌株生物膜形成能力的研究

目的 比较在不同压力条件下,单增李斯特菌1/2c血清型与其他血清型菌株生物膜形成能力,以了解单增李斯特菌1/2c血清型菌株的环境适应能力。方法 采用96孔培养板结晶紫染色法,检测不同温度、不同培养基、不同pH值条件下,单增李斯特菌1/2c血清型与其他血清型菌株的生物膜形成能力。结果 在25 ℃、TSB、10%TSB和pH 7~8条件下,1/2c血清型菌株生物膜形成能力强于其他血清型菌株(P0.05)。结论 在室温、富营养/低营养条件、中性略偏碱性环境中单增李斯特菌1/2c血清型菌株的生物膜形成能力强于其他血清型菌株,提示可能是食源性单增李斯特菌1/2 c血清型菌株分离率较高的原因之一,为该菌的预防控制措施提供了参考依据。     

大肠杆菌O157：H7 OI115岛的多态性分析

目的研究大肠杆菌0157：H7测序菌株EDL933的OI115岛在肠杆菌科细菌中的分布。方法用PCR和杂交方法检测OI115岛的21个基因，同时进行该岛序列测定。结果OI115岛和SPI-1毒力岛的分布特点相似，具有种属局限性。仅在大肠杆菌中存在，在EPEC、CTEC、EAggEC均可检测到该岛的缺失形式，在沙门菌、志贺菌、耶尔森、摩根菌等其他肠杆菌科细菌中未发现该岛的存在。在不同类别的致泻性大肠杆菌中，Oi115岛也各有特点，共检测到该岛的3种存在形式。产生志贺毒素的大肠杆菌O157：H7菌株、2株EAggEC和2株不典型大肠杆菌均具有完整的OI115岛。在不产生志贺毒素的大肠杆菌O157中具有H5、H12、H29、H42、H11、H19、H26、H10、H21鞭毛型的菌株缺失了第3基因簇，具有H16鞭毛型的菌株第2、第3基因簇同时缺失。结论本研究发现，OI115岛在致泻性大肠杆菌中分布广泛，可能和病原菌的进化有关。     

模拟粪便标本单增李斯特菌和伊氏李斯特菌TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法

目的建立一种TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR),用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测。方法以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因,合成2对引物和其相应的荧光探针,制作标准曲线,建立从模拟粪便标本中直接检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan双重real-time PCR。利用李斯特菌属中其他种李斯特菌及常见致病菌验证引物、探针的特异性;通过制备模拟粪便标本并对其进行二次增菌后,分别提取DNA,采用TaqMan双重real-time PCR进行检测,以达到快速检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的。结果采用本研究建立的TaqMan双重real-time PCR对模拟粪便标本的检测结果显示特异性良好,与其他种李斯特菌和其他病原菌均无交叉反应。模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的检测下限分别为2.45×103cfu/g和2.92×103cfu/g;模拟粪便标本在3 h内可得出检测结果,当模拟粪便标本中单增李斯特菌含量为6 cfu/g和伊氏李斯特菌含量为5 cfu/g时,经过增菌后使用双重real-time PCR可检测出阳性结果。结论本研究建立了以单增李斯特菌的特异基因hly和伊氏李斯特菌的特异基因smcL为靶基因的TaqMan双重realtime PCR检测方法,该方法具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点,可用于临床、食品及环境标本的快速诊断,以及我国人群中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的携带或感染状况的调查分析。