基于EV71交叉保护抗原P1的前体蛋白B细胞抗原位点的预测

目的获得EV71P1保守氨基酸序列COBRA EV71 P1和基于此序列的B细胞抗原表位预测信息。方法从NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下载获取1970-2010年间世界各地暴发流行的包含P1或VP1基因片段的EV71源序列和对应的氨基酸序列,根据VP1基因片段信息构建系统进化树,对源序列进行基因分组;对多基因型的EV71 P1氨基酸源序列采用多序列比对,以优势氨基酸位点代替差异氨基酸位点的方法,获得EV71 P1保守序列（COBRA EV71 P1）,并运用IEDB Analysis Resource （http：//tools.immuneepitope.org/main/）在线预测工具和DNASTAR软件里的Protean模块,运用单参数和二级结构预测综合考虑的方法,对COBRA EV71 P1前体蛋白的B细胞抗原表位进行预测。结果成功比对出COBRA EV71 P1氨基酸序列,预测结果发现在COBRA EV71 P1前体蛋白的第10-24,41-60,68-82,208-225,328-345,498-514,592-609,664-678,772-786和841-855位点均具有较好的亲水性、表面可及性、柔韧性和抗原指数,并且在二级结构上含有易形成抗原表位的无规则卷曲和β-转角,有可能是COBRA EV71 P1前体蛋白的优势表位。结论经生物信息学分析,推测COBRA EV71 P1可能具有三个基因型EV7 1P1前体蛋白的候选B细胞线性抗原表位,为EV71重组多表位疫苗设计和多基因型病毒样颗粒疫苗实验提供了理论基础。     

牛胚胎干细胞建系的现状与展望

胚胎干细胞是能在体外培养中保持自我更新和多分化潜能的细胞。因此,牛胚胎干细胞系是基因工程、治疗性克隆、发育生物学、人类疾病动物模型研究的良好实验载体。公认的胚胎干细胞系已在小鼠和灵长类动物中建立。虽然关于牛类胚胎干细胞的报道也已有不少,但是真正的牛胚胎干细胞建系尚未获得成功。本文将综述当前牛胚胎干细胞建系的研究进展并对其中存在的问题,如胚胎分离胎龄、牛胚胎干细胞识别与鉴定、培养条件和与分化相关细胞因子和信号通路等,进行探讨并提出可能采取的解决办法。     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

鱼卵小分子多肽对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖作用的影响

目的观察不同浓度的鱼卵小分子多肽对SD大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)增殖作用的影响。方法分离、培养SD大鼠BM-MSCs,并采用流式细胞仪进行鉴定。选取第3代细胞进行观察和检测。实验组选取25、50、75、100、125、150、200、250、300μg/ml 9个多肽浓度,对照组加入不含小分子多肽的DMEM完全培养基。各组孵育24 h后采用MTT法检测其细胞增殖情况,确定其最佳作用剂量。在最佳作用量下,于12、16、20、24、32、40、48 h 7个时间点观察鱼卵小分子多肽对SD大鼠BM-MSCs增殖的情况。并采用流式分析鱼卵小分子多肽对BM-MSCs细胞周期的影响。结果鱼卵小分子多肽对BM-MSCs的促增殖作用的最佳浓度为100μg/ml,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。流式分析显示鱼卵小分子多肽可提高SD大鼠BM-MSCs非G1/G0期细胞比例。结论鱼卵小分子多肽对SD大鼠BM-MSCs有促增殖作用,最佳作用浓度为100μg/ml。     

SD大鼠胚胎上胚层干细胞的分离与培养

目的从SD大鼠胚胎中获取附植后胚胎上胚层干细胞（post-implantation epiblast stem cells,Episc）,并探讨组织来源、胎龄、细胞因子、传代方法等条件对SD大鼠Episc（SD Episc）分离与培养的影响。方法分别取5.5d和7.75d胎龄囊胚上胚层（epiblast）,以昆明小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层,于添加白血病抑制因子（leucocyte inbibitory factor,LIF）或活化素（activin）的基础培养基中,进行原代培养。分别采用机械法和胰酶消化法对克隆集落进行传代。最后通过碱性磷酸酶染色对克隆集落进行鉴定分析,并对其体外分化能力进行检测。结果培养于LIF培养基和activin培养基中的囊胚均发生严重分化。培养于LIF的培养基中的epiblast也发生了严重的自发分化。而在activin培养基中,epiblast形成SD Episc原代集落。经机械法传代获得AKP染色阴性、能形成拟胚体的SD Episc。结论利用细胞因子activin,结合机械传代法可从7.75d胎龄SD大鼠胚胎中获得SD Episc。     

中国大陆EV71病毒分离株的分子流行病学研究

目的 了解1987-2010年中国大陆肠道病毒71型(EV71)分离株的分子流行病学特点及其种系进化、基因分型和遗传变异性.方法 从GenBank/NCBI上获得中国大陆来源的具有完整VP1或近似完整VP1基因的核苷酸序列信息的413株EV71毒株进行分析,采用MEGA 5.0软件,构建系统进化树,计算相同或不同基因型及基因亚型毒株的核苷酸与氨基酸的相似性.结果 1987-2010年,中国大陆20个省、市或地区均分离到具有完整VP1序列的毒株,且2008年以来数量陡增;中国大陆流行的主要是C型,只有2008年安徽和2009年湖北发现了A型;各基因型在43、58、142、164、167、184、240、249、292等氨基酸位点发生了特异性变异;从健康人体内分离的HQ129932毒株与其他序列比较,氨基酸无特异性变异.结论 C型株可能具有更强的传染力;氨基酸位点变异对于EV71病毒进化有重要意义;VP1基因与疾病的严重程度无明显关联;应加强C4a亚型疫苗候选疫苗株对其他基因型毒株的交叉保护作用研究.     

细粒棘球蚴全长cDNA文库的构建及初步鉴定

目的　分离目的基因构建cDNA文库的经典方法繁琐且不易得到全长cDNA(3’和 5’端 ,尤其是基因的 5’非翻译区 )。本研究通过构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,筛选全长目的基因 ,研究其结构和功能。方法　采用TRIZOL试剂提取E .granulosus总RNA ,用ClonTech公司的SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建E .granulosus原头节全长cDNA文库 ,文库的包装使用EICENTERTECHNOLOGIES公司提供的包装蛋白。结果与结论　成功构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,文库滴度为 1.4× 10 7pfu/ml。文库的重组效率达到 99%以上 ,插入片段长度约为 1.1kb。     

中国寨卡病毒分离株E基因B细胞抗原表位多态性分析

目的研究中国寨卡病毒分离株的E基因多态性及其B细胞抗原表位的分布及变异情况。方法从NCBI中下载所有中国分离的寨卡病毒株、主要输入地委内瑞拉和萨摩亚的病毒株,从免疫表位数据库中检索获得寨卡病毒的B细胞抗原表位。使用MEGA7.0软件进行序列比对,分析中国寨卡分离株的基因变异情况及抗原表位的多态性。结果中国所有寨卡分离株均为亚洲型,E基因上有19个单核苷酸突变,其中3个异义突变,只有5个突变位点与来自委内瑞拉和萨摩亚的病毒株的突变位点相同。已验证的寨卡病毒B细胞抗原表位均存在于E蛋白上,尤其是DⅢ结构域。中国分离株和MR766株相比有3个B细胞表位发生改变,中国分离株自身产生的变异导致1个表位改变,B细胞表位的变异位点主要存在于DⅢ结构域。结论中国寨卡分离株总体变异率不高,与输入地病毒株相比也产生变异。有3个B细胞表位发生变异,DⅢ结构域是E蛋白上重要的抗原位点所在域且突变率高。     

抗菌肽的现状与未来

抗菌肽是一种由生物体产生的具有抗菌活性的肽类物质,广泛存在于细菌、真菌、动物和植物中。抗菌肽不仅具有广谱抗菌活性,还具有抗病毒、抗寄生虫和抗癌等多种活性,其应用前景十分广阔。本文就抗菌肽的发现,现在的研究状况,以及抗菌肽在未来发展中的应用前景作一综述。     

细粒棘球蚴细胞系(13G-5)鉴定

:【目的】鉴定 13G 5细胞系细胞是否来源于细粒棘球蚴细胞。【方法】用不同代次的细胞系细胞接种Km小鼠腹腔 ,观察是否形成包囊或类似包囊 ,病理切片证实 ;用形成的包囊材料进行体外培养 ;测定接种小鼠的特异抗体效价 ;用酯酶同工酶鉴定细胞系。【结果】细胞系细胞在小鼠腹腔能形成包囊或类似包囊 ,病理切片观察包囊结构清楚 ,体外培养 ,未能见到细胞贴壁生长和活原头节 ,将培养悬液涂片 ,吉姆萨染色后镜检 ,只见到极少量细胞 (类似于生发层细胞 ) ,也未见到原头节。实验鼠抗体滴度的倒数为 32 0～ 5 12 0之间 ;酯酶同工酶检测结果 :细粒棘球蚴原头节、13G 5细胞系细胞、包囊液含有相同的酯酶同工酶谱 ,在同一位点出现相同的一条酶带。【结论】 13G 5细胞系来源于细粒棘球蚴细胞。