基因转染表达小鼠白细胞介素-33及其抗肿瘤机制研究

目的 建立分泌小鼠白细胞介素-33(IL-33)的基因转染细胞株,分析其特性并探讨IL-33在肿瘤微环境中的抗肿瘤作用.方法 构建含有人CD8信号肽基因序列的IL-33融合基因,经BamH I和EcoR I双酶切后插入pCDEF3真核表达载体构建成为pCDEF3-IL-33重组子,采用脂质体法以重组质粒pCDEF3-IL-33和空质粒pCDEF3分别转染小鼠乳腺癌细胞株4T1,经G418长期加压筛选后,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测基因转染细胞株培养上清中小鼠IL-33的分泌和IL-33体外对效应性CD8+T细胞干扰素(IFN)-γ的分泌;活细胞计数和羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)掺入法检测基因转染细胞生长与增殖的均一性.结果 基因转染细胞4T1-pCDEF3-IL-33能稳定分泌小鼠IL-33分子,其培养上清中的表达量为28 μg/L;与4T1及转染了空质粒pCDEF3的4T1-vec比较,其生长和增殖差异无统计学意义(P＞0.05);体外刺激试验表明,IL-33能显著地促进效应性CD8+T细胞分泌IFN-γ,对照组为125 μg/L,实验组为300μg/L,差异有统计学意义(P＜0.05);体内实验研究表明,分泌于肿瘤微环境中的IL-33能显著抑制肿瘤的生长和转移,第30天时肿瘤直径对照组为(18.0±2.5) mm,实验组为(6.5±0.9)mm,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 建立了稳定分泌小鼠IL-33的基因转染细胞株,微环境中的IL-33对肿瘤具有显著的抑制作用.     

B7-H3Ig重组蛋白的真核表达及其对T细胞的作用

目的 真核表达人B7-H3Ig重组蛋白,探讨B7-H3信号在T细胞中的作用.方法 重叠PCR方法构建B7-H3Ig重组基因,进而获得重组逆转录病毒载体pGEZ-Term/B7-H3Ig,转染L929细胞建立L929/B7-H3Ig基因转染细胞株,纯化获得B7-H3Ig重组蛋白.体外激发型CD3单克隆抗体(mAb)刺激活化T细胞过程中加入B7-H3Ig,观察其对T细胞增殖以及IL-10与IFN-γ分泌的作用.结果 B7-H3Ig经Protein G柱纯化后纯度＞90％,浓度达0.559 mg/mL.重组蛋白结合实验表明CD3 mAb刺激48 h后T细胞表面B7-H3受体表达达到高峰.B7-H3Ig以剂量依赖方式促进CD3 mAb诱导的T细胞体外增殖与IL-10和IFN-γ分泌.结论 成功建立真核表达人B7-H3Ig基因转染细胞株,B7-H3Ig协同刺激T细胞增殖与IL-10和IFN-γ分泌.     

辐射对树突状细胞的影响及其机理的研究

目的：研究γ射线对树突状细胞（DCs)生长及其功能原影响。方法：采用γ射线对单核细胞来源的DCs进行照射，经流式细胞仪表型分析、活细胞计数，混合淋巴细胞反应等方法测定γ射线对DCs的生物学效应。结果：γ射线照射抑制DCs的体外增殖，显著地下调DCs表达GM－CS－FR、flt-3和gp130分子，但能上调DCs表达CDD80、CXD86和HLA－DR分子；同时γ射线照射增强DCs激发T细胞的增殖，抑制DCs对抗原摄取的能力。结论：γ射线照射能量影响DCs的成熟和功能。     

肿瘤细胞冻融裂解物上清对凋亡细胞负载的树突状细胞生物学特性的作用研究

目的:探讨Balb/c小鼠骨髓瘤SP2/0细胞冻融裂解物上清对SP2/0凋亡细胞负载的骨髓来源的树突状细胞(DC)的成熟、生物学特性及功能的影响。方法: 采用小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导骨髓来源的DC, 100Gyγ射线辐照诱导SP2/0细胞凋亡, 与未成熟DC共育16-20h;SP2/0细胞冻融裂解物上清和脂多糖(LPS)分别作用于DC48h。采用免疫荧光标记和流式细胞术分析DC表型;[³H]-TdR掺入试验和[⁵¹Cr]释放试验测定DC刺激T细胞增殖和细胞杀伤效应。采用腹股沟皮下DC主动免疫治疗SP2/0荷瘤小鼠, 每间隔14d治疗1次, 共3个疗程, 观察肿瘤生长情况及小鼠生存期。结果:(1)经SP2/0冻融裂解物上清和脂多糖(LPS)诱导凋亡肿瘤细胞负载的DC高表达共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子, 但抗原摄取能力均下降;(2)SP2/0冻融裂解物上清组和LPS组DC体外刺激T细胞增殖和激活CTL能力均高于对照组(P＜0.05);(3)经SP2/0冻融裂解物上清组主动免疫治疗小鼠存活期长于其它各组(P＜0.05)。结论:小鼠SP2/0细胞冻融裂解物上清可诱导凋亡细胞负载的树突状细胞成熟, 能够刺激T细胞增殖和激发肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL), 主动免疫治疗可激发荷瘤小鼠体内有效的肿瘤特异性免疫力, 延长荷瘤小鼠生存期。     

肿瘤患者外周血单个核细胞来源DC的体外诱导及其功能

目的: 研究肿瘤患者外周血单个核细胞来源的树突状细胞（monocytederived dendritic cells, MoDC）共刺激分子的表达及其功能。方法：选取11例肺癌、卵巢癌和胃癌患者及10例正常志愿者，分别经粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating fact     

人外周血单核细胞来源的DC体外分化成熟影响因素的研究

目的： 探讨不同因素对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)体外分化成熟的影响。方法：通过流式细胞仪表型分析、混合淋巴细胞反应、抗原摄取能力检测、DC对T细胞的趋化能力及对IL10的拮抗效应的测定，研究了TNFα，FL，sCD40L，CD40mAb，gp130，IL10等不同因素对DC的体外分化成熟及功能的影响。结果：CD40信号和TNFα都可以有效地使DC上调表达共刺激分子CD80，CD86并进而促进DC激发T细胞的增殖和活化及对T淋巴细胞的趋化作用，但在体外培养体系中，sCD40L能有效地拮抗IL10的抑制效应，而TNFα则明显不如sCD40L有效；激发型gp130单克隆抗体和人重组FL可以显著地促进DC的体外扩增，但是无明显地促进DC分化成熟和促进DC激发T细胞的功能。结论：CD40和TNFα都具有促进DC分化、成熟的能力，但CD40的作用明显优于TNFα。     

分泌独特型免疫球蛋白BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤模型的建立

目的： 构建分泌独特型免疫球蛋白(idiotype, Id) 的BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤细胞株，建立动物模型，为进一步开展Id树突状细胞(dendritic cell, DC)疫苗的免疫治疗提供物质基础。 方法： 采用降植烷和不完全弗氏佐剂间隔致敏6～8周龄BALB/c小鼠，继而采用细胞融合技术、ELISA法、免疫荧光标记和流式细胞术(flow cytometry, FCM) 筛选获得分泌Id的阳性克隆；体内诱生腹水和体外无血清培养法制备Id，优球蛋白沉淀法结合凝胶Suphecray200过滤纯化Id；建立荷瘤模型，从荷瘤小鼠骨髓前体细胞诱导DC。 结果：获得2株稳定分泌Id的BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤细胞SB4和SB5，Id均为IgM/κ；成瘤率均为100%，荷瘤小鼠平均生存期为（30±4） d。 结论： SB4和SB5能持续稳定分泌非自身反应性Id，具有良好的成瘤性和高转移率。     

2型糖尿病血清可溶性共刺激分子B7-H3与颈动脉粥样硬化斑块的相关性研究

目的探讨血清可溶性共刺激分子B7-H3(soluble co-stimulatory molecule B7-H3,sB7-H3)与2型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)患者合并颈动脉粥样硬化(carotid atherosclerosis,CAS)的相关性。方法选择87例临床诊断T2DM患者作为研究组,另外选择33例非T2DM人群作为对照组。入选的糖尿病患者根据有无颈动脉粥样硬化斑块分为T2DM无颈动脉斑块组(T2DM-NCAS)与T2DM有颈动脉粥样硬化斑块组(T2DM-CAS)。应用酶联免疫法(ELISA)检测所有研究对象的血清可溶性共刺激分子B7-H3水平。结果 T2DM-NCAS组的sB7-H3水平显著高于对照组(P0.05),T2DM-CAS组的sB7-H3水平显著高于对照组(P0.05),T2DM-CAS组的sB7-H3水平显著高于T2DM-NCAS组(P0.05)。血清sB3-H7水平与颈动脉斑块Crouse积分呈正相关。ROC曲线分析显示sB7-H3对于2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化斑块形成有诊断价值(P0.05)。结论血清sB7-H3可能参与2型糖尿病患者动脉粥样硬化斑块的形成、发展;sB7-H3或可作为2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化斑块严重程度的评估指标。     

天花粉蛋白联合CD40信号激发的人MoDC介导Th2细胞分化的研究

探讨天花粉蛋白(Tk)联合CD40信号诱导人单核细胞来源DC(MoDC)的成熟活化及其介导Th2细胞分化的作用和机制。采用GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导人MoDC,并利用鼠抗人CD40激发型单抗(5C11)刺激负载了Tk的DC制备成熟DC。采用免疫荧光标记和流式细胞术分析DC表型(CD80、CD83、CD86、CD14、PDL1)及其摄取FITC-Dextran的能力;ELISA法测定DC上清中IL-12p70的含量;胞内染色和流式细胞术检测经成熟DC活化的T细胞中CD4~+IFN-γ~+T和CD4~+IL-4~+T的比例。实验结果显示单独Tk不能刺激DC完全成熟,用Tk负载DC后必须联合外源性成熟刺激信号(如5C11),才能有效促进DC成熟,表现在CD80、CD83、CD86的上调表达,CD14下调表达,DC摄取FITC-Dextran的能力降低。与CD40信号单独诱导组相比,Tk联合CD40信号诱导的成熟DC表面PDL1分子呈下调表达,分泌IL-12的能力显著降低,明显提高T细胞中CD4~+IL-4~+T的比例。由此表明负载了Tk的成熟MoDC体外能有效介导Th2细胞分化。     

CD40配基化的肿瘤特异性树突状细胞介导Th1细胞分化的研究

目的：探讨CD40配基化的肿瘤特异性DCs在介导Th1细胞分化中的作用。方法：采用GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导小鼠髓系DCs，并利用mCD40L-CHO和TNF-α分别刺激凋亡肿瘤细胞负载的DCs制备DCs瘤莆；^3H-TdR掺入试验检测DCs对T淋巴细胞的促增殖效应；ELISA测定细胞培养上清中IL-10、IFN-1、IL-12的含量；胞内染色和流式细胞术检测经成熟DCs活化的T细胞中CD4^＋IFN-γ^＋T和CD4^＋IL-4^＋T的比例。结果：体外刺激T细胞增殖能力在CD40配基化DCs组最高（P〈0．05），CD40配基化DCs能更有效地促进活化T细胞分泌IFN-γ和介导CD4^＋IFN-γ^＋T细胞的分化（P〈0．05）。同时，CD40配基化DCs分泌IL-12的量也明显高于TNF-α组（P〈0．05）。结论：CD40配基化的肿瘤特异性DCs体外能有效介导Th1细胞的分化。