不同浓度葡萄糖对sf9细胞生长特性及蛋白表达的影响

目的 研究不同浓度葡萄糖对昆虫细胞sf9生长特性及蛋白表达的影响.方法 将对数生长期的sf9细胞在含不同浓度葡萄糖的Hyclone无血清培养基(serum-free medium,SFM)中培养.采用台盼蓝拒染法监测细胞密度,分析比较不同浓度葡萄糖对sf9细胞生长特性的影响.然后,将对数生长期的sf9细胞在含不同浓度葡萄糖的Hyclone SFM中培养表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型L1蛋白.以蛋白印迹法鉴定并分析比较不同浓度葡萄糖对sf9细胞表达蛋白的影响.结果 4个不同葡萄糖浓度实验组的细胞增殖速率及最大细胞密度均大于不加葡萄糖的对照组.两个较低葡萄糖浓度组的细胞凋亡率低于对照组,最高葡萄糖浓度组的细胞凋亡率则高于对照组.另外,加葡萄糖的8个实验组的蛋白表达量均高于不加葡萄糖的对照组,其中,3个较高葡萄糖浓度组显示有目的 蛋白的降解条带.在另外5个没有出现降解条带的实验组中,以培养过程中间补加葡萄糖浓度至15 mmol/L的实验组蛋白表达量最大.结论 葡萄糖可促进sf9细胞增殖,不同浓度葡萄糖对细胞凋亡的影响不同;适宜浓度的葡萄糖可提高sf9细胞表达完整外源蛋白的量.     

重组人乳头瘤病毒58型L1蛋白在Sf9细胞中的表达条件优化

目的 采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统扩增人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型L1蛋白基因,确定L1蛋白表达的最佳条件.方法 取处于埘数生长期的S19细胞以不同的感染复数(MOI)值扩增病毒,用噬斑试验检测病毒滴度,确定扩增重组病毒的最适条件;用间接免疫荧光法判断目的蛋白表达情况;通过蛋白印迹法测定不同的表达时间和MOI值条件下目的蛋白表达量,确定目的蛋白的最佳表达条件.结果 处于对数生长期的细胞以MOI值为0.5表达48 h条件下扩增含HPV58 LI基因的重组杆状病毒,滴度最高,可达5×108pfu/ml;以MOI值为5.0表达72 h获得最佳的目的蛋白表达量.结论 确定了扩增病毒和表达相应目的蛋白的最佳条件.     

重组人乳头瘤病毒58型L1蛋白在Sf9细胞中的表达条件优化

Objective To select the optimum conditions for amplification and expression of the recombinant human papillomavirus 58 (HPV58) LI gene using baculovirus-insect cell expression system. Methods The Sf9 insect cells at logarithmic phase was used to amplify virus at different multiplicities of infection (MOI). Titers of the virus were determined by plaque assay. The expression of recombinant protein was identified by indirect immunofluorescence assay, and the expression of recombinant protein at different MOI and time was determined by Western blot. Results Recombinant baculovirus containing HPV58 LI gene were amplified at MOI of 0.5 for 48 h when the Sf9 insect cells were at logarithmic phase, and the highest titers of the virus reached 5×108 pfu/ml. The optimum conditions for expressing the recombinant protein were that the recombinant baculovirus was inoculated at MOI of 5.0 and the protein was expressed within 72 h. Conclusion The optimum conditions for amplifying the virus and expressing the recombinant protein are determined.     

含编码人乳头瘤病毒18型L1蛋白基因的杆状病毒扩增及相应蛋白表达的条件优化

目的 确定以昆虫细胞sf9扩增含编码人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型L1蛋白(HPV18 L1)基因的杆状病毒以及相应蛋白表达的最佳条件.方法 以对数生长期的sf9细胞在不同感染复数(MOI)和不同时间条件下扩增病毒,以蚀斑试验检测病毒滴度,选择获得最高滴度病毒的最佳条件;再以sf9细胞在不同细胞密度、不同MOI值和不同时间条件下表达相应蛋白,以蛋白印迹法鉴定并比较不同条件下的蛋白表达量,选择获得最大量目的 蛋白的最佳条件.结果 对数生长期的sf9细胞在MOI值为0.50、扩增时问为48 h时,所扩增的病毒滴度最高,可达3×108 pfu/ml;在细胞密度为3×106/ml、MOI值为2.0、表达时间为72 h时,所表达的蛋白量最大,约5 mg/L.结论 确定了含编码HPV18 L1基因的杆状病毒扩增及相应蛋白表达的最佳条件.     

中药复方抑瘤饮影响荷S180瘤小鼠免疫功能的动态研究

研究荷S180瘤小鼠灌服中药复方抑瘤饮(简称抑瘤饮)不同时间点脾细胞免疫功能的动态变化,揭示其体内抗瘤的免疫机制。于BALB/c小鼠右腋皮下接种S180细胞,24 h后,抑瘤饮组开始每日灌服抑瘤饮,对照组灌服等量凉开水。分别于灌服第0、10、20、30、40天处死动物,称取体重和瘤重;无菌获取脾细胞,MTT法检测NK细胞杀伤活性、ConA诱导转化及IL-2诱生活性,流式细胞仪检测CD4+细胞和CD8+细胞百分率。结果显示,抑瘤饮对小鼠体内S180移植肿瘤的生长,有明显的渐增性抑制作用;抑瘤饮能够明显逆转S180移植肿瘤对小鼠脾细胞的NK细胞杀伤率、转化指数、IL-2诱生活性、CD4+细胞和CD8+细胞百分率的抑制作用,且逆转作用呈时间依赖性增强。表明抑瘤饮体内能够渐增地上调被S180移植肿瘤抑制的免疫功能,从而发挥抗瘤作用。     

细菌耐药背景下中药抗菌作用研究进展

自青霉素被发现以来,抗菌药物被广泛应用于临床中,为人类的健康生活做出了巨大的贡献,但也由此产生了日渐严重的细菌耐药问题。中药材在中国有着数千年的临床使用历史,至今未发现明显的耐药菌产生,其作用可见一斑。中药的开发利用对解决细菌耐药性问题有非常大的潜力。作者就耐药菌的现状及抗耐药菌中药复方、单味中药、中药单体的实验研究结果作一简要综述,以期为临床用药以及中药新药研发提供参考。     

基因工程丁肝抗原的获取和鉴定

目的获取有生物活性的基因工程丁肝抗原蛋白,探讨其作为诊断试剂的应用价值。方法合成人工编码的丁肝小抗原基因;以M48为载体,构建重组表达质粒;进行原核表达;以亲和层析纯化并以Western blotting和ELISA鉴定该蛋白。结果酶切鉴定构建的表达质粒正确;SDS-PAGE电泳结果显示该蛋白与预期分子质量大小一致;Western blotting和ELISA结果显示该蛋白能与丁肝抗体特异性结合。结论成功获取了有生物活性的基因工程丁肝抗原蛋白,可以1∶1000稀释度作为包被抗原替代丁肝抗体诊断试剂成分,用于ELISA检测。     

重组人乳头瘤病毒11型L1蛋白在昆虫细胞sf 9中的表达条件优化研究

Objective To determine the optimum conditions for expressing recombinant human papillomavirus 11 (HPVI1) L1 protein using haculovirus-insect cell expression system. MethodsThe expression of the recombinant protein was identified by indirect immunofluorescence assay, and the optimum conditions for expressing the recombinant protein at different multiplicities of infection (MOI) and time were determined by Western blot. Results The optimum conditions for expressing the recombinant protein were that the recombinant baeulovirus was inoculated at MOI of 2.0 when the density of sf 9 cell was 2.0 × 106/ml, and the protein was expressed through suspension culture within 96 h. Conclusions The optimum conditions for expressing the recombinant protein are determined, which is to provide reference for further expression and purification in large quantity.     

一种改良的环介导恒温扩增技术在甲型肝炎病毒核酸检测上的应用

目的 建立一种更加快速简便的环介导恒温扩增技术(LAMP)检测甲型肝炎病毒(HAV).方法 本研究通过在传统LAMP的基础上加入加速引物建立了一种改进型的LAMP体系.结果 精确性和可重复性实验证实改进后的HAV LAMP检测体系稳定可靠,重复性强,并且较传统的LAMP灵敏度更高,检测极限可以达到5 TCID50/ml.当该方法用于甲型肝炎患者急性期血清临床样本的检测时,实验结果与TaqMan实时荧光定量PCR的检测结果一致.结论 改进型的LAMP技术有望应用于HAV临床样本检测,同时也适用于HAV流行地区的病原学监测和调查.     

基因优化对基因工程丁型肝炎小抗原蛋白表达和纯化的影响

目的 探讨基因优化对基因工程丁型肝炎(丁肝)小抗原蛋白表达和纯化的影响.方法 依据GenBank上的丁肝小抗原原始基因,参照大肠埃希菌优势密码子谱进行优化;再分别将优化前后的两组基因进行常规原核表达,用SDS-PAGE电泳比较目的蛋白表达量及优势表达方式;进一步以柱层析进行纯化,再以Image Lab软件分析SDS-PAGE电泳条带,比较两组目的蛋白的纯度.结果 SDS-PAGE显示,两组表达的目的蛋白均与预期相对分子质量大小一致,优化基因组的蛋白表达量高于原始基因组,且更倾向于可溶性表达;经柱层析纯化后,前者的目的蛋白纯度也明显高于后者,可达96.3％.结论 基因优化可提高基因工程丁肝小抗原蛋白表达量,增加可溶性蛋白的比例;且表达产物更易纯化至较高纯度以供诊断使用.