问号钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA转录和表达特征的研究

目的 确定我国不同基因种问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株携带毒力相关基因invA的情况,了解问号钩体赖株感染细胞前后invA基因转录和表达水平的变化.方法 采用PCR检测4个不同基因种问号钩体株及双曲钩体Patoc Ⅰ株invA基因.克隆问号钩体全长invA基因并测序,构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株invA基因原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rlnvA后免疫家兔获得抗血清,免疫双扩散法检测其效价.建立问号钩体赖株感染人胚肾上皮细胞HEK293模型,采用荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测问号钩体赖株感染HEK293细胞前后invA基因的转录和表达水平的变化.结果 4个不同基因种的问号钩体株均含有invA基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.4株不同基因种的问号钩体invA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.33%～100%和98.66%～100%.所构建的原核表达系统能有效地表达rInvA.rInvA兔抗血清免疫双扩效价为1:16.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min以后可大量黏附于细胞表面.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min时,invA基因mRNA水平明显上调,45 min时达到峰值,然后逐渐下降.问号钩体赖株感染HEK293细胞后45 min和60 min时可检出InvA蛋白,感染前及感染90 min以后检测结果均为阴性.结论 invA基因是致病性问号钩体所特有的基因.invA基因具有宿主细胞接触式表达及瞬时表达的特点,与问号钩体侵入宿主细胞密切相关.     

多重半巢式聚合酶链反应检测巨细胞病毒DNA多聚酶基因

目的：探讨多重半巢式聚合酶链反应（msnPCR)在研究巨细胞病毒（CMV）DNA多聚酶基因（UL-54）中的应用价值。方法：从8例心肺移植患者血标本中提取DNA,以CMV-UL54为模板,自行设计6条特异性引物,建立msnPCR扩增系统。扩增产物在DNA测序仪上自动测序。结果：msnPCR能扩增出427bp和1052bp两条目的片段,扩增产物测序表面存在导致氨基酸改变的碱基有义突变。结论：msnPCR扩增结合测序,可检测CMV-UL54的7个功能区目片段中的碱基突变,msnPCR比普通PCR更加省时和经济。     

呼吸道合胞病毒G蛋白基因重组质粒诱导小鼠免疫保护性及机制研究

目的 构建编码呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白基因的重组质粒,观察其对RSV感染小鼠的保护性及特异性免疫效应,为研制安全有效的RSV新疫苗提供线索和实验依据.方法 利用基因重组方法构建含RSV G蛋白编码基因的重组质粒,测序和酶切鉴定,Western blot检测目的 基因经体外表达后的免疫原性.重组质粒免疫小鼠后以RSV感染,病毒滴定法检测肺组织标本中RSV滴度,HE染色法检查肺组织病理改变,ELISA检测血清抗体水平,双抗体夹心ELISA测定肺泡灌洗液(BALF)内Th1/Th2细胞因子表达量,流式细胞术检测BALF中T淋巴细胞亚群数量及活化状态.结果 成功构建了编码RSV G蛋白基因的重组质粒pcDNA3.1~G.Western blot证实目的 蛋白在体外具有免疫原性.被免疫小鼠感染RSV后肺组织病毒滴度降低,肺组织中未见明显的炎性细胞浸润.小鼠血清中产生较高滴度的抗RSV-G IgG.小鼠BALF细胞中CD4~+CD25~+T淋巴细胞比例显著增加,并且IFN-γ(Th1)、IL-4(Th2)两类细胞因子表达显示平衡.结论 编码RSV G蛋白基因的重组质粒pcDNA3.1~G能诱导产生CD4~+ CD25~+T细胞亚群,对小鼠具有明显的保护作用.     

FasL相关蛋白SH3P12影响FasL细胞膜表达效应研究

目的 研究FasL相关蛋白SH3P12对FasL表达的影响。方法 构建SH3P12真核细胞表达载体，并与FasL共同短暂表达于人胚肾细胞293T细胞。以免疫共沉淀和免疫印迹法确定目的蛋白之间的相互作用，以免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察SH3P12与FasL在细胞内表达。结果 在转染的293T细胞中，SH3P12与FasL可形成免疫共沉淀的蛋白-蛋白复合物。荧光蛋白标记结合显微镜观察提示在无SH3P12存在时，FasL主要分布于293T细胞膜，并伴随部分蛋白表达在细胞内高尔基体或内含体样颗粒中；在有SH3P12存在时，FasL与SH3P12形成复合体，共同定位于细胞膜，此时细胞内表达FasL量明显降低。结论 SH3P12为FasL细胞内结合蛋白，其生物学活性可能为稳定FasL在细胞膜上的表达。     

骨髓移植受者巨细胞病毒感染的研究

目的　探讨巨细胞病毒在骨髓移植受者中的感染状况。方法　应用酶联免疫吸附反应方法、免疫组化方法及多聚酶链反应术后同步测定 3 0例骨髓移植受者的抗巨细胞病毒抗体、巨细胞病毒抗原和巨细胞病毒核酸 ,共 2 71例次。结果　骨髓移植受者的抗CMVIgG和抗CMVIgM阳性率分别为 10 0 %和 1 8% ;CMV Ag阳性细胞数平均为 5 1± 3 9/5× 10 4WBC ,阳性率为 3 6 2 % ;CMV DNA的阳性率为 42 4%。两者同时阳性共86份 ,占 3 1 7%。结论　骨髓移植受者术后存在不同程度的CMV感染。临床上同步开展CMV抗体、抗原及核酸的检测对早期诊断骨髓移植受者术后CMV感染具有重要意义     

《中国药典1990年版二部》简介

建国已来,我国已先后出版了四版药典,即1953、1963、1977和1985年版药典,以及数百个部颁药品标准。1988年还首次向国外发行了1985年版药典的英文版。现中国药典1990年版及即将出版,该版仍分一、二部,共收载1751种中西药品(USP     

重度子痫前期75例临床分析

目的探讨重度子痫前期终止妊娠的时间和方法对孕产妇和围生儿的影响。方法回顾性分析2005年1月～2007年6月我院收治的75例重度子痫前期患者的临床资料,对一般资料、并发症发生情况、终止妊娠的时机和方法及孕产妇和围生儿结局进行分析。结果本组75例患者中的68例行剖宫产终止妊娠,除2例合并胎盘早剥围生儿死亡之外(其中1例入院时即为死胎,胎盘重度早剥),其余均母婴健康;7例经阴道分娩。结论适时、恰当的方法终止妊娠是降低孕产妇及围生儿并发症和死亡率的有效措施,且并不影响剖宫产率。     

γδT细胞杀肿瘤细胞过程中溶酶体运动及肌动蛋白纤维、T细胞受体重排特征研究

目的观察γδT细胞溶解肿瘤靶细胞过程中溶酶体运动特征，了解T细胞受体、肌动蛋白纤维在效应，靶细胞接触区域的分布特征，探讨TST细胞抗肿瘤生物学活性的可能机理。方法Lysotracker Red-DND99标记的TST细胞与人恶性黑色素瘤MeWo细胞共同培养，激光共聚焦显微镜实时观察御细胞杀伤肿瘤细胞过程中溶酶体运动过程及其特点。TST细胞与MeWo细胞共同培养后甲醛固定，以rhodsmine phalloidin标记肌动蛋白纤维或anti-TCRδ1-FTTC抗体标记T细胞受体，激光共聚焦显微镜观察TST细胞及肿瘤细胞之间免疫突触形成特征。结果TST细胞可快速识别并集聚于肿瘤细胞周围。在与肿瘤细胞直接接触的10min内，将胞内溶酶体成分“倾吐”于肿瘤细胞后随之离开。肿瘤细胞受大量TST细胞攻击后约60min，出现细胞膜皱缩、变圆，约80min死亡。在上述效应，靶细胞接触作用过程中，肌动蛋白纤维及T细胞受体均匀分布于TST表面，不出现在效应，靶细胞接触区域富集现象。结论TST细胞通过与肿瘤细胞直接接触，释放其细胞内溶酶体内含物直接杀伤肿瘤细胞。与细胞毒性T淋巴细胞不同，TST细胞与肿瘤细胞之间不形成典型的免疫突触。     

呼吸道合胞病毒感染对细胞凋亡及FasL、Fas、Bcl-2、Bax基因表达的研究

目的：研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染与细胞凋亡的关系及对凋亡相关基因FasL、Fas、bcl-2和bax表达的影响。 方法： 采用A549细胞，在RSV感染后不同时点收集细胞，流式细胞仪和透射电镜检测细胞凋亡，免疫组织化学法检测凋亡相关基因FasL、Fas、Bcl-2和Bax表达情况。 结果： 流式细胞仪检测结果RSV感染后72 h（6.61%）、120 h（10.94%）的细胞凋亡指数明显高于对照组（4.32%、5.31%）；免疫组化法检测结果对照组FasL、Bax基因呈现无表达或局部弱表达；随着RSV感染时间的延长，bax、 Fas、 FasL基因的表达均高于对照细胞，bcl-2基因呈现弱表达或无表达。 结论： RSV在感染后期能诱导宿主细胞发生凋亡，促凋亡基因FasL、Fas 、Bax和抗凋亡基因Bcl-2表达水平的差异是RSV诱导凋亡的机制之一。     

心肺移植患者巨细胞病毒耐更昔洛韦基因突变研究

目的　建立并应用人巨细胞病毒 (HCMV)行列探针检测 (LiPA)技术 ,快速检测心肺移植患者HCMV耐更昔洛韦 (GCV)基因突变。方法　以HCMV UL97基因为靶序列 ,设计 13条特异性寡核苷酸探针 ,用Nested PCR扩增目的基因 ,LiPA技术检测与耐药有关的碱基突变。并对Nested PCR产物平行做直接序列测定 ,与LiPA结果比较。结果　 16例心肺移植患者 ,LiPA技术检测发现 4例患者存在HCMV UL97基因突变 ,突变分别发生在编码子 5 2 0 ,5 95及 6 0 3,与直接序列测定比较 ,两者完全吻合。结论　长期应用GCV预防及治疗HCMV感染可以诱导病毒耐药 ,LiPA技术可作为检测HCMV基因突变的一种有效手段。