纳米羟基磷灰石/聚氨基酸复合材料的生物相容性研究

目的:评价新型骨内固定生物材料纳米羟基磷灰石(Nanohydroxy apatite,nHA)/聚氨基酸的生物相容性.方法:对nHA/聚氨基酸复合材料生物相容性进行体外及体内评价,分别进行以下实验:①细胞毒性试验,材料与兔骨髓间充质干细胞共同培养,倒置相差显微镜观察细胞生长,CCK-8检测细胞增殖情况.②急性毒性试验,KM小鼠20只,雌雄不限,体重20～23 g,分两组(n=10),分别按50 g/kg注射材料浸提液及生理盐水,观察小鼠毒性表现.③溶血试验,分3组,分别取10 ml材料浸提液、灭菌蒸馏水、生理盐水,各加入0.2ml新鲜抗凝兔血测溶血率.④热源试验,新西兰大白兔3只,雌雄不限,体重2.3～2.5 kg,按10ml/kg注射材料浸提液,测量正常体温与注射后连续3 h内每小时体温的差值.⑤微核试验,KM小鼠30只,雌雄不限,体重20～23 g,分3组(n=10),分别按100 g/kg间隔24h注射材料浸提液、环磷酰胺及生理盐水2次,观察骨髓嗜多染红细胞及含微核小体的骨髓嗜多染红细胞,计算微核率.结果:nHA/聚氨基酸复合材料对骨髓间充质干细胞无毒性,无急性毒性,溶血率正常,无致热源,无微核试验遗传毒性.结论:nHA/聚氨基酸复合材料具有良好的生物相容性,有望用作骨内固定材料.     

尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒.方法:从人尤文肉瘤A673细胞中提取总RNA,以RT-PCR法扩增EWS-FLI1基因序列,目的基因两侧引入Sac Ⅰ和HindⅢ酶切位点,克隆至pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆作PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定.再将EWS-FLI1基因亚克隆至原核表达载体pQE30中,构建重组原核表达质粒pQE30-EWS-FLI1,酶切及测序鉴定.所构建的重组质粒转化JM109,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,进行Western blot鉴定.结果:PCR结果显示扩增片段大小约为1.5 kb,双酶切鉴定目的基因片段大小约为1.5 kb,阳性克隆测序结果显示目的基因序列与预期相同.所构建重组质粒在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的54 kD蛋白,经鉴定系EWS-FLI1蛋白.结论:成功构建了pQE30-EWS-FLI1,并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白HLA-A2.1限制性CTL表位的预测、筛选及鉴定

目的预测、筛选及合成尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白HLA-A2.1限制性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)表位,初步鉴定EWS-FLI1表位肽。方法综合运用BIMAS、SYFPEITHI、Predep和IEDB方案对EWS-FLI1蛋白进行HLA-A~*0201限制性CTL表位的预测,应用多项式方案、量化基序方案对预测的CTL表位进行筛选,并将筛选的CTL表位与HLA-A~*0201分子进行动力学模拟,应用标准Fmoc方案合成CTL表位肽;通过表位多肽刺激CTL释放颗粒溶素的检测,以及靶细胞杀伤实验验证表位多肽的免疫效应。结果综合预测得出了8个可能的表位肽,进一步筛选确定其中4个肽为候选合成表位,应用分子动力模拟初步验证了4个候选表位肽与HLA-A2.1分子的结合力,合成的各条肽经色谱分析纯度均在98%以上,经质谱分析各肽的分子量测定值与理论值相符,颗粒溶素释放实验及靶细胞杀伤实验证实了筛选的表位均能产生刺激效应,其中,表位肽QIQLWQFLL(EWS-FLI1 304)的刺激效应最为显著。结论综合运用多个方案可提高预测效率,分子动力学模拟可初步验证表位肽与HLA-A~*0201的结合力,所合成的多肽为高纯度肽,通过免疫学实验初步鉴定了EWS-FLI1的表位。     

高龄坐骨神经鞘膜瘤显微外科治疗1例

目的提高对坐骨神经鞘膜瘤的诊治水平。方法对典型病例进行规范化手术治疗。结果针对病变进行彻底切除,显微镜下小心分离保护神经束避免误伤,术后病检证实术前诊断无误,术后未出现医源性神经损伤。结论显微镜下操作、囊内切除、修复神经外膜等系列规范操作,是手术治疗神经鞘膜瘤获得满意效果的保障。     

经后路自体髂骨椎间植骨椎弓根固定治疗峡部裂型腰椎滑脱42例疗效分析

目的观察经后路椎体间融合(Posterior lumbar interbody fusion,PLIF)自体髂骨椎体间植骨结合椎弓根固定治疗峡部裂型腰椎滑脱的临床疗效。方法对42例腰椎滑脱症患者采用PLIF自体髂骨椎体间植骨结合椎弓根螺钉复位内固定治疗,采用Nakai评分标准评价治疗效果。通过随访进行疗效评定。结果 42例患者随访1～6年,术后滑脱椎体平均复位率为92.5%,术后平均椎间隙高度为10.2mm,较术前增加5.2mm;植骨融合率为95.2%,平均融合时间6个月;临床症状按Nakai标准:优34例,良6例,可2例。结论经后路自体髂骨椎体间植骨结合椎弓根固定治疗峡部裂型腰椎滑脱,植骨融合率高,临床效果满意。     

不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景:骨髓间充质干细胞常被用作骨组织工程的种子细胞和基因治疗的载体细胞,如何获得纯度较高活性较好的骨髓间充质干细胞是很多研究者关心的问题.目的:观察不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响.方法:分别用密度梯度离心法、全骨髓培养法和红细胞裂解液法提取兔骨髓间充质干细胞,48 h后观察各组获得的细胞量,记录各组首次传代时间,相差显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪鉴定其CD44抗原表达.分别用DMEM-LG、MEM-HG和DMEM/F12 3种培养基培养第3代细胞和第7代老化细胞,MTT法和计数板计数法比较不同时间点3种培养基培养细胞的生长情况,相差显微镜观察老化细胞的形态变化.结果与结论:3种分离方法均能得到较均一的梭形或者多角形贴壁细胞,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性.其中红细胞裂解液法获得的贴壁细胞的量较其他方法多,首次传代时间短(P＜0.05).用DMEM/F12培养的细胞活力更好,细胞生长更迅速,并且经过DMEM/F12培养一段时间后,部分静止期细胞开始分裂增殖.提示红细胞裂解液法能够提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,是一种方便、有效的提取方法;DMEM/F12更能够促进细胞的增殖,较适合于培养骨髓间充质干细胞.     

关节软骨修复细胞基因治疗中软骨细胞支架载体特点

目的 探讨四种不同类型三维支架中培养的关节软骨细胞活性状况及其转基因特性.方法 原代培养兔膝关节软骨细胞,并且以表达绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(GL3)的腺病毒载体AdGFP和AdGL3进行感染.在I型胶原海绵、纤维蛋白胶、透明质酸和聚乳酸四种类型的支架材料中,以荧光显微镜和荧光素酶分析法检测细胞的活性状况及其转基因特性;以阿辛蓝染色评价软骨基质的产生.结果 表达绿色荧光蛋白的腺病毒(AdGFP)成功感染兔关节软骨细胞,并且持续表达绿色荧光蛋白.被感染的软骨细胞在所有被测试的细胞支架上均能存活,并能表达GFP和荧光素酶报告基因.与其余三种支架比较,聚乳酸支架中转基凶表达率最高(P<0.01).而且聚乳酸培养体系中,4周时可以检测到阿辛蓝染色阳性的基质材料.结论 在关节软骨修复的细胞基因治疗领域,聚乳酸可能是一种合适的支架材料.     

B型超声诊断法在骨科的应用：附51例分析

B型超声对骨骼本身疾病的诊断尚有困难,但利用B超对软组织的良好分辨力及对液体的高度敏感性来协助骨、关节疾病的诊断却有其可能。近5年来我们对脊柱结核是否存在椎旁或腰大肌冷脓肿;膝关节半月板有无撕裂;肢体包块性质的判断及关节内、外感染的鉴别等进行了初步探索。现将经手术或造影证实的51例报告如下。     

基因治疗在骨科的应用

随着分子生物学和生物化学的不断进步 ,我们发现了多种蛋白质 (因子 )在骨科领域具有治疗前景 ,但是外源性给予蛋白质进行治疗效果有限甚至无效[1] ,限制了它们的应用。另外 ,许多有治疗效果的蛋白质并不是分泌型因子 ,而是在细胞内或附着于细胞表面才能发挥作用[2 ] ,有必要发