脐血间充质干细胞的体外培养及其表面标志变化*☆

背景：目前有关脐血间充质干细胞的体外培养和大规模扩增方法不一,存在一定困难。 目的：观察脐血间充质样干细胞体外分离和培养的方法,并检测其表面分子的变化。 方法：取新鲜采集脐带血,用1.077 g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。将脐血单个核细胞接种于37 ℃、含体积分数为5%CO2培养箱内培养。于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况。 结果与结论：从脐血中分离出的单个核细胞,培养中先出现大量的造血细胞集落,CFU-GM与BFU-E集落形成最多,集落分别增加了(37.1±2.3)和(10.4±1.7)倍,瑞氏染色显示这些细胞大多数为粒系的集落(80.1±85.2)%,其次为红系的细胞集落(14.2±1.8)%,7 d后出现贴壁的扁平状上皮样细胞和长梭形成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂。扩增后第14天经流式细胞仪分析CD38+细胞为1.64%,CD34+/CD38+细胞为1.71%,CD34+/CD38-细胞为0.55%,PI+细胞为0.05%,Annexin-V+细胞为0.18%。随着培养时间的延长,细胞数目不断增加,培养21 d时,单个核细胞扩增了近7.8倍.,第28天增加了1.71倍。经流式细胞仪分析CD38+细胞为74.32%,CD34+/CD38+细胞为1.61%,CD34+/CD38-细胞为0.24%。提示脐血间充质干细胞可以体外培养。     

端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间质干细胞的实验

背景:人骨髓间充质干细胞经过有限次的细胞传代后,就会停止增殖,发生衰老和死亡。有研究表明,端粒与细胞寿命的控制密切相关,是否可通过外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达,诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性,维持端粒长度的稳定,从而延长人骨髓间充质干细胞的生命周期并保持其多潜能分化特性?目的:观察外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达对人骨髓间质干细胞端粒酶活性及细胞生命周期的影响。设计:重复测量实验。单位:郑州大学医学院干细胞研究中心。材料:实验于2003-10/2005-12在郑州大学医学院干细胞研究中心完成。人骨髓间质干细胞采自郑州大学第一附属医院及第三附属医院小儿外科和门诊20名健康志愿者。增强型绿色荧光蛋白-C1质粒和增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒由加拿大Dr.ChantalAutexier馈赠。DH5α菌株由郑州大学医学院重点分子医学实验室侯卫红博士馈赠。方法:无菌条件下,抽取健康志愿者胸骨骨髓2mL,经离心、洗涤及传代培养后备用。①阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果:将第5代人骨髓间充质干细胞接种至24孔培养板中,将携带有增强型绿色荧光蛋白报告基因和人端粒酶逆转录酶目的基因的质粒pEGFP-人端粒酶逆转录酶通过脂质体转染法转入人骨髓间充质干细胞中,转染共分4组:正常对照组、脂质体组、增强型绿色荧光蛋白-C1质粒组、增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒组,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增。②人骨髓间充质干细胞转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶活性的检测:通过RT-PCR和PCR-ELISA对选用转染增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转H人骨髓间充质干细胞第5代)、转染增强型绿色荧光蛋白-C1质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转C人骨髓间充质干细胞第5代)、未转染的第10代人骨髓间充质干细胞、K562细胞(阳性对照)转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达情况,对转H第5及30代人骨髓间充质干细胞、转C第5代人骨髓间充质干细胞及未转染的第10代人骨髓间充质干细胞端粒酶活性的影响进行检测。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析:采用胰蛋白酶-Giemsa染色法转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定:将转染细胞在重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的联合诱导下向神经元样细胞定向诱导分化,并用RT-PCR进行鉴定(蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达)。主要观察指标:①不同转染组阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果。②不同转染组人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶的活性。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析结果。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定结果。结果:①随G418浓度的下降,正常对照组、脂质体组细胞全部死亡,从而得到稳定表达增强型绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞;经G418加压筛选后得到1个连续传到第35代且生长旺盛的抗性细胞克隆,倒置显微镜下观察与未转染人骨髓间充质干细胞相比无明显差异。②转C第5代人骨髓间充质干细胞和未转染第10代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阴性,而K562和转H第5代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阳性。③转H第5代人骨髓骨髓间充质干细胞组和转H第30代人骨髓间充质干细胞端粒酶为阳性。④转H人骨髓间充质干细胞第10,20,30代的染色体总数均为23对,且含2条X性染色体,仍为正常2倍体,染色体形态和数目均正常。⑤较多转H人骨髓间充质干细胞出现了典型的神经元样形态,且经RT-PCR检测表明,神经元特征性蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达增强。结论:外源性人端粒酶逆转录酶基因可以在人骨髓间充质干细胞中获得异位表达,并能诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性。外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达不仅可以使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。     

人脐血间充质样细胞体外培养的形态学变化

目的:分离培养人脐血间充质样细胞,观察其形态学的变化.方法:取新鲜采集脐带血,用1.077 g/cm3的淋巴细胞分层液密度梯度离心法分离脐血单个核细胞.将脐血单个核细胞接种于37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养.于不同时间观察细胞形态的变化.结果:从脐血中可以分离出单个核细胞;培养3 d出现大量的造血细胞集落,瑞氏染色显示粒-巨噬系集落形成单位与红系集落形成单位集落形成最多;培养5 d出现贴壁的扁平状上皮样细胞和长梭形的成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂;培养1周出现上皮样细胞和成纤维样细胞的集落,此时经胰蛋白酶消化机械吹打可以传代;培养2周以上,出现上皮样细胞的克隆,镜下呈现球形样结构,折光性强.结论:脐血成分复杂,在体外分离培养可以获得形态各异的脐血间充质样细胞.     

脐血干细胞移植对帕金森病大鼠神经功能恢复的影响

目的:观察脐血干细胞移植对帕金森病(PD)大鼠神经功能恢复的影响.方法:PD大鼠模型分成实验组(n=10)和对照组(n=10).将第三代脐血间充质干细胞(MSCs)用Hoechst33258标记后植入实验组大鼠纹状体内,对照组注射PBS.此后每周腹腔注射阿朴吗啡以观察神经功能恢复情况,并在2周,4周,8周用免疫荧光双标法检测MSCs的存活,迁移以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP),神经元特异性烯醇化酶(NSE),酪氨酸羟化酶(TH)和突触素的表达.利用高效液相色谱-电化学检测仪(HPLC-ECD)检测纹状体多巴胺含量.结果:脐血MSCs移植后大鼠的旋转行为与对照组相比有明显改善(P＜0.05);MSCs可在大鼠脑内存活,随时间延长,迁移范围扩大,分布于纹状体,胼胝体和皮质;GFAP,NSE,TH都有表达,突触素无表达.多巴胺水平与对照组相比有明显提高(P＜0.05).结论:脐血MSCs有望成为治疗PD的种子细胞,为神经退行性变提供一种治疗方法.     

hTERT-逆转录病毒载体构建及其介导的脐血间质干细胞基因转移研究

目的：构建hTERT-逆转录病毒载体，向脐血间质干细胞（MSCs）中导入hTERT基因，观察该基因对细胞端粒酶活性的影响，能否延长细胞的寿命以及转基因细胞的分化能力。方法: PCR法扩增出hTERT全部片段，定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内，筛选阳性产毒细胞，测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs，筛选转基因细胞。检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达，端粒酶活性的变化，hTERT转入后对细胞增殖的影响。用5-氮杂胞苷将转基因细胞向心肌方向诱导，检测心肌特异抗体的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒，证明PLNCX2-hTERT构建成功，转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达，细胞端粒酶阳性。生长曲线显示转基因细胞增殖速度快于未转染细胞。向心肌细胞诱导后，心肌特异性抗体 α-sarcomeric actin和connexin-43均有表达。结论:在逆转录病毒介导下，外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达，激活细胞端粒酶的活性，有效延长了细胞的寿命，不影响其分化功能。     

针刺镇痛与睾酮、双氢睾酮的关系

针麻是个复杂的生理调节过程,其除了神经系统的作用外,还有体液因素的参与。近年来实验证明针刺可提高血浆中亮啡肽,ACTH,肾上腺皮质激素的含量,并且针麻效果与这些体液因素有密切关系。另有资料表明针刺可提高血浆睾酮的含量,关于睾酮水平的改变对针刺镇痛的效果是否有影响,目前尚未见报道,本文试对该问题     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的非造血干细胞,在体外一定条件下可向神经细胞分化。本实验通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs,并用脑源性神经营养因子(BDNF)、forskolin(FSK)和多巴胺(DA)联合对BMSCs进行诱导,电子显微镜观察诱导后细胞是否具有成熟神经元的超微结构特点;免疫细胞化学和RT-PCR检测DA能神经元分化过程中的标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达以及转录因子Nurr1、Ptx3、和Lmx1b的表达。结果显示:诱导2周后,电镜下可见细胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体,以及神经丝。RT-PCR结果显示NSE(neuron specific enolase)、Nurr1、Ptx3、Lmx1b和TH的mRNA均有表达;免疫细胞化学表明诱导2周后TH阳性细胞的表达较诱导3d后明显提高。上述结果表明BDNF、FSK和DA可以在体外诱导人BMSCs定向分化为DA能神经元。     

开封市市售仿瓷餐具中甲醛含量的调查研究

目的了解开封市市售仿瓷餐具中甲醛含量的现状,为进一步指导仿瓷餐具的监管和使用提供科学依据。方法随机抽取市售仿瓷餐具65份进行检测,采用GB/T5009.178-2003示波极谱仪法对抽取的样品检测。结果随机抽查样品的测定结果,集贸露天市场所采集的仿瓷餐具合格率为51.9%,大型连锁超市,合格率为81.6%以上。结论在今后的工作中多向市民进行仿瓷餐具相关知识的宣传,对于劣质的仿瓷餐具要求卖家下架。     

Aβ25-35对体外培养大鼠神经干细胞分化的影响

目的 探讨β淀粉样蛋白（Aβ25-35）对体外培养神经干细胞分化的影响和机制.方法 分离培养新生SD大鼠经干细胞,加入10%的胎牛血清使其分化7 d时,一部分细胞用Aβ25-35作用12 h,观测细胞生长状态,运用免疫细胞化学和免疫蛋白印记迹术研究各组Tau蛋白在Ser396,Ser262位点磷酸化水平变化及活化型GSK-3β[pTyr279,216]的表达水平.结果 呈球形生长的神经干细胞在加入胎牛血清培养液后,逐渐从球的周边分化出神经细胞,长出神经细胞样的触突,在Aβ25-35作用下,分化细胞的突起粗大且生长速度较快.免疫细胞化学染色和Western-blot结果显示,所有分化细胞都有Tau[pS396]、Tau[pS262]、GSK-3β[pTyr279,216]表达,但经Aβ处理后表达量增高.结论 Aβ25-35可通过上调GSK-3β的表达提高Tau蛋白磷酸化水平,促进神经干细胞向神经细胞分化.