增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体构建及其在移植干细胞示踪和定量中的初步应用

目的：构建增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体，并观察其在移植真皮多能干细胞示踪和定量中的应用。 方法：实验于2004-08／2005-10在解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所完成。①细菌内同源重组构建含增强型绿色荧光蛋白基因的骨架质粒，PacⅠ酶切后转染293细胞，包装出增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体。增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体鉴定正确后，收集293细胞反复冻融离心收集上清，粗制病毒液感染293细胞，扩增重组病毒载体。②选取新生1d雄性大鼠1只作为供体，剪取皮肤进行真皮多能干细胞的分离培养鉴定。将第7代粗制病毒液加人生长状态良好的真皮多能干细胞，转染后5d观察绿色荧光蛋白阳性细胞数量，计数绿色荧光蛋白阳性细胞百分比。③选取60只成年Wistar大鼠作为受体，随机分为全身照射组和正常对照组，各30只。全身照射组大鼠接受总剂量为5Gy的1射线照射，正常对照组不接受放射。两组大鼠均接受尾静脉移植的1mL增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体转染的真皮多能干细胞悬液。两组分别于照射后5d，1，2，3，4周荧光显微镜下观察真皮多能干细胞在骨髓组织中的分布情况，每个时相点6只大鼠；同时定量分析骨髓中真皮多能干细胞的含量。 结果：作为受体的60只大鼠全部进入结果分析。成功地构建了增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体，并发现其可转染和标记真皮多能干细胞。增强型绿色荧光蛋白标记的真皮多能干细胞在移植后4周内在大鼠体内的分布可被有效地检测，荧光激活细胞分类结果显示全身照射组大鼠骨髓中真皮多能干细胞的含量从移植后5d～4周均明显高于正常对照组大鼠（P〈0．01）。 结论：增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体可有效地标记真皮多能干细胞，并能很好地示踪和定量分析移植到大鼠体内真皮多能干细胞的分布情况。     

电离辐射对伤口中性粒细胞的影响及康复新的促愈作用

目的：研究电离辐射对伤口中性粒细胞数量和部分功能的影响及康复的作用。方法:从置入大鼠背部的海绵中收集中性粒细胞,测定其数量和吞噬、运动功能变化。结果：伤后24－48h,4、6、8Gy全身照射复合创伤组,伤口白细胞和中性粒细胞数量均显著低于单创组,且中性粒细胞吞噬功能和运动功能也降低。康复新对单纯创伤、6Gy放射复合伤组伤口中性粒细胞数量和功能有明显的提高。结论：创伤愈合早期,伤口中性粒细胞数量和功能的下降是全身照射引起愈合延迟的原因之一;康复 新的促愈合作用与提高伤口中性粒细胞数量和功能有关。     

真皮多能干细胞移植后向全身照射大鼠骨髓优势分布的机制研究

目的探讨静脉输注的真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,dMSCs)向全身照射(total body irradiation,TBI)大鼠骨髓优势分布的机制.方法 RT-PCR和荧光免疫化学检测骨髓中基质细胞源性细胞因子(stromal-derived factor-1,SDF-1)的表达水平,以及dMSCs中SDF-1的受体CXCR4的表达水平.Transwell培养体系中,观察SDF-1对dMSCs的趋化作用.结果 TBI大鼠骨髓SDF-1的表达水平明显高于正常大鼠,同时dMSCs表达CXCR4.体外趋化实验发现,SDF-1对dMSCs有很强的趋化作用,而使用SDF-1的中和性抗体后,TBI大鼠骨髓提取液对dMSCs的趋化作用明显下降(P<.05).结论 TBI大鼠骨髓局部上调表达的SDF-1在移植dMSCs向骨髓的优势分布中有重要作用.     

新型升血小板因子的免疫原性实验研究

目的明确自行研制的新型升血小板因子是否具有免疫原性。方法分别用佐剂、新型升血小板因子＋佐剂、新型升血小板因子、鸡卵清蛋白＋佐剂免疫Balb／c小鼠,采用琼脂免疫扩散试验和酶联免疫吸附试验（EIJSA）检测小鼠血清中的抗体。结果ELISA法未检测到血清中的抗体;琼脂免疫扩散试验血清经72h扩散观察未出现沉淀线,没有形成抗原．抗体复合物。结论用新型升血小板因子免疫Balb／c小鼠,未发现能够刺激小鼠产生抗新型升血小板因子抗体。     

小鼠小肠上皮细胞经γ射线照射后蛋白质组差异分析

目的　分析γ射线照射后 ,在辐射损伤期和修复期小鼠肠上皮细胞蛋白质组的改变 ,以探讨肠上皮细胞损伤与修复的分子机理。方法　采用 9Gy全身照射BALB c小鼠 ,分别于照射后3h和 72h取小肠制备卷肠切片 ,染色并观察小肠形态。分离未照射小鼠及照射后 3h和 72h小鼠的肠上皮细胞 ,制备蛋白样品 ,采用双向电泳技术分离样品 ,PDQuest软件处理双向电泳图谱 ;并对差异的蛋白质点进行肽质量指纹分析。结果　小鼠肠上皮在照射后 3h以损伤性改变为主 ,72h后出现明显再生修复。采用双向电泳技术在正常对照组、照射后 3h组以及照射后 72h组分别检测到(6 38± 39)、(5 6 6± 32 )和 (5 91± 2 9)个蛋白质点。对其中 2 8个差异蛋白质点进行了肽质量指纹分析 ,经数据库检索 ,初步鉴定为一些与代谢、过氧化应急、信号转导相关的蛋白质。结论　电离辐射能诱导小鼠肠上皮细胞蛋白表达的改变 ,双向电泳技术对从整体方面揭示辐射损伤的分子机理有重要价值。     

人树突状细胞体外提呈与EB病毒感染相关肿瘤抗原的研究

目的建立从人骨髓造血前体细胞体外培养扩增树突状细胞的方法 ,制备 EBV感染介导的相关肿瘤 (如何杰金氏病、鼻咽癌和 Burkitt's淋巴瘤等 )的疫苗。方法采用 Mini- MACS分离技术从正常人骨髓分离 CD34+ 造血干 /祖细胞 ,体外以重组细胞因子组合诱导培养 2周 ,同种混合淋巴细胞反应检测扩增 DCs的 T淋巴细胞刺激活性。结果从正常人骨髓分离得到高纯度 (>90 % )的 CD34+造血干 /祖细胞 ,经重组 h GM- CSF、h TNF- α、h IL- 3、h IL- 4的共同诱导培养 ,扩增得到大量DCs。扩增的 DCs表面具有不规则突起 ,高表达共刺激分子 CD1α,对同种异体 T淋巴细胞具有很强的刺激活性 ,负载抗原后刺激活性进一步增强。结论人 CD34+ 造血干 /祖细胞体外经 h GM- CSF、h TNF-α、h IL - 4、h IL - 3共同诱导培养 ,可生成大量功能成熟的 DCs,并可有效提呈与 EBV感染相关肿瘤的抗原 ,可望用于 EBV感染介导相关肿瘤的疫苗治疗。     

放烧复合伤小鼠小肠粘膜免疫变化与肠源性感染关系的 …

目的 探讨放射损伤,烧伤与放射复合伤后小鼠小肠粘膜免疫变化及其用细胞因子调控后与肠源性感染的关系。方法 采用斑点杂交,免疫组化,免疫酶联吸附实验,细菌培养等方法。结果（１）三类伤组伤后均出现小肠粘液ｓＩｇＡ含量显著降低,浆细胞烽量减少,肠道细菌移居增多,肠系膜淋巴结ＩＬ－４ｍＲＮＡ表达降低,尤以复合伤组最重。（２）用ＩＬ－４蛋白调控后,三类伤组肠道浆细胞的数量增多,小肠粘液中ｓＩｇＡ含量相应增加,     

放烧复合伤小鼠小肠粘膜免疫变化与肠源性感染关系的研究

目的探讨放射损伤、烧伤与放烧复合伤后小鼠小肠粘膜免疫变化及其用细胞因子调控后与肠源性感染的关系。方法采用斑点杂交、免疫组化、免疫酶联吸附实验、细菌培养等方法。结果①三类伤组伤后均出现小肠粘液ｓＩｇＡ含量显著降低,浆细胞数量减少,肠道细菌移居增多,肠系膜淋巴结ＩＬ４ｍＲＮＡ表达降低,尤以复合伤组最重。②用ＩＬ４蛋白调控后,三类伤组肠道浆细胞的数量增多,小肠粘液中ｓＩｇＡ含量相应增加,肠道细菌移居减少。结论伤后粘液中ｓＩｇＡ的降低与肠源性感染的发生密切相关,其原因与分泌ｓＩｇＡ的淋巴细胞数量减少和功能障碍有关;而促进粘膜免疫功能恢复,对减低肠源性感染发生较为有利     

新型异黄酮及甾体类化合物抗辐射作用的实验研究

目的对进行改构的两种异黄酮类化合物F12、F2及一种甾体类化合物ZE1进行体外、体内实验,寻找一种新型的抗辐射药物。方法以Genistein和雌二醇为阳性对照,应用MTT法对比研究三种化合物在不同的浓度对IEC-6、巨核细胞系-Dami细胞株细胞增殖活性的影响;并观察其对8Gy和12Gy60Co-γ射线照射小鼠肠道及造血辐射防护效果。结果F2、F12、ZE1在不同浓度对IEC-6及Dami细胞均有不同的辐射防护作用,效果显著优于Genistein和雌二醇（P〈0.01）。动物实验结果显示F2使辐射损伤小鼠的骨髓和脾脏有核细胞数量增加,肠上皮细胞绒毛高度增加,隐窝变长,效果与雌二醇相当,而未观察到明显的毒副反应。结论经过特定结构修饰的异黄酮类化合物F2,有较好的辐射保护作用,同时无明显的雌激素样作用,提示可能是较为理想的辐射防护剂候选药物。     

去甲肾上腺素促进骨髓间充质干细胞增殖的研究

目的 观察去甲肾上腺素对骨髓问充质干细胞增殖的影响及其作用途径.方法 将BMSCs细胞随机分为3组:①正常对照组;②去甲肾上腺素(10~(-6)～10~(-4)mol/L)处理组;③酚妥拉明(10~(-6)mol/L)采+去甲肾上腺素(10~(-5)mol/L)处理组.采用3H-TdR掺入实验榆测不同实验组对BMSC8增殖的影响;免疫组化和免疫印记法检测去甲肾上腺素埘蛋白激酶C的作用.结果 ①10~(-6)～10~(-4) mol/L的去甲肾上腺素作用8 h后均促进了骨髓问充质干细胞的增殖,并且在10~(-5)mol/L时去甲肾上腺素对骨髓问充质干细胞的促增殖作用最为显著;②酚妥拉明阻断了去甲肾上腺素埘骨髓间充质干细胞的促增殖作用;③去甲肾上腺素诱导蛋白激酶c从细胞质到细胞膜转位,酚妥拉明抑制了去甲肾上腺素诱导的蛋白激酶C激活.结论 去甲肾上腺素能够促进骨髓间允质干细胞的增殖,并且这种促增殖作用足通过肾上腺素能受体、蛋白激酶C信号通路来调节的.