广西何首乌GXHSWAQⅠ在鼻咽癌细胞放射增敏过程中对基因HIF-1α的影响

目的:探讨广西何首乌中蒽醌类化合物GXHSWAQⅠ,在鼻咽癌CNE-1细胞的放射增敏过程中对乏氧诱导因子表达的影响.方法:MTT比色法确定GXHSWAQⅠ对鼻咽癌CNE-1细胞株体外增敏剂量和放射增敏比,HE染色观察GXHSWAQⅠ放射增敏后细胞形态学的改变,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测GXHSWAQⅠ作用前后,乏氧诱导因子HIF-1α的表达情况.结果:无细胞生长抑制作用浓度的GXHSWAQⅠ低浓度(3.90 mg/L)和高浓度(7.80 mg/L)组的放射增敏比分别为1.23和1.58,放射和联合用药的细胞发生明显的细胞形态学改变,同时下调基因HIF-1α的表达.结论:GXHSWAQⅠ对鼻咽癌CNE-1细胞具有放射增敏作用,其机制与下调乏氧诱导因子HIF-1α表达有关.     

RNA干扰抑制c-jun基因表达对放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R放射敏感性的影响

目的 利用RNA干扰技术抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,研究其对CNE-2R细胞放射敏感性的影响及其潜在机制.方法 设计合成3组特异性针对c-jun基因的siRNA,构建慢病毒vshRNA载体,感染CNE-2R细胞,采用RT-PCR和Western blot方法检测各组对目的基因的抑制效果;并通过克隆形成实验测定其放射敏感性,CCK-8实验检测细胞的存活能力,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 重组慢病毒c-jun-RNAi-LV2能明显下调CNE-2R细胞中c-jun的mRNA和蛋白水平的表达(F=217.20、42.07, P<0.05).6 MV X射线联合c-jun-RNAi-LV2组在0、2、4、6和8 Gy照射后细胞的吸光度值均显著低于未转染组和阴性对照组(F=42.70~200.67, P<0.05).克隆形成实验显示,c-jun-RNAi-LV2组与未转染组及阴性对照组相比,SF₂、D₀和D_q值均减小,放射增敏比(SER_D0)为1.41.细胞凋亡实验结果显示,未经照射的c-jun-RNAi-LV2组与联合2 Gy照射的凋亡率分别为(20.93±1.99)%和(38.17±0.83)%,均高于未转染组和阴性对照组的凋亡率[0 Gy:(10.97±0.70)%和(20.43±0.25)%;2 Gy:(10.80±1.25)%和(19.53±1.50)%;F=50.54、330.14, P<0.05].结论 RNA干扰技术可有效抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,使细胞放射敏感性增高,其作用可能与c-jun基因的下调使细胞增殖能力减弱,细胞凋亡增多有关.     

Ⅱ期鼻咽癌同步放化疗与单纯放疗的疗效

目的 比较Ⅱ期鼻咽癌同步放化疗与单纯放疗的疗效。 方法 收集2007年6月至2014年4月在我院接受同步放化疗的Ⅱ期鼻咽癌患者56例为同步组,同期行单纯放疗的Ⅱ期鼻咽癌患者51例为单放组。对两组患者生存状况进行回顾性分析,比较两组总生存率、无远处转移生存率、无局部区域复发生存率及无失败生存率。 结果 同步组与单放组相比,各种生存率差异均无统计学意义（P均＞0.05）,两组总生存率、无远处转移生存率、无局部区域复发生存率及无失败生存率的风险比（HR）分别为1.15 （95%CI＝0.21~6.36）、1.10 （95%CI＝0.26~4.73）、1.16 （95%CI＝0.33~6.89）、1.38 （95%CI＝0.36~5.25）。多因素分析提示年龄是无局部区域复发生存率的预后因素（P=0.030）,年龄越大生存率越低。 结论 与单纯放疗相比,同步放化疗未能改善Ⅱ期鼻咽癌患者的预后,调强放疗联合同步化疗对Ⅱ期鼻咽癌预后的影响还需进一步研究。     

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用。方法：根据GenBank数据库提供的CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl设计原则,设计选择双链小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,再设计合成为能表达其小发卡结构RNA（small hairpin RNAs,shRNA）的DNA序列,并与pGPU6／GFP／Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。结果：经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT—PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达。结论：CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功。     

慢病毒介导的靶向干扰PARP-1基因乳腺癌稳定细胞株的构建

Objective To construct a PARP-1 lentivirus interference vector and establish a stably infected human breast cancer MDA-MB-231 cell line. Methods According to genetic information of PARP-1 cDNA sequence provided by GenBank,a targeted PARP-1 lentiviral vector was constructed. Both the lentiviral vector and virus packaging plasmids were transfected into 293T cells to produce recombinant lentivirus,which was infected into the human breast cancer MDA-MB-231 cell line（PARP-1 group）. Negative control and blank control groups were also prepared. The mRNA and protein expression of PARP-1 was measured using real-time quantitative PCR and Western blot. Results PARP-1-RNAi lentiviral vector was constructed and infected into MDA-MB-231 cells. The mRNA expression levels of PARP-1 in blank control group,negative control group and PARP-1 group were,respectively,1.001±0.056,1.022±0.021 and 0.166±0.041; the relative expression levels of PARP-1 protein were 0.963±0.006,0.943±0.008 and 0.573±0.011. Compared with the blank control group and negative control group,the expression of PARP-1 mRNA and protein was significantly lower in the PARP-1 group（P<0.05）. Conclusion A breast cancer cell line stably expressing low levels of PARP-1 has been established.     

不同浓度二磷酸氯喹和雷帕霉素对CNE-2细胞自噬的影响

目的 探讨不同浓度二磷酸氯喹和雷帕霉素对人鼻咽低分化鳞癌(CNE-2)细胞自噬的影响.方法 利用Western-blot技术检测CNE-2细胞经不同浓度二磷酸氯喹(chloroquine disphosphate,CDP)和雷帕霉素(rapamycin)处理后自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62的表达情况.以碘化丙啶(propidineiodide,PI)染色技术分别检测CNE-2细胞经抑制自噬最明显的CDP及rapamycin浓度处理后的细胞凋亡率.结果 Western-blot结果示,CNE-2细胞经不同浓度CDP和rapamycin处理后LC3-Ⅱ和p62蛋白均有不同程度表达.CDP处理组中20.60mg/L浓度组LC3-Ⅱ和p62表达水平均明显高于其他各浓度组(F1 =719.388,F2=73.885,P均＜0.01);rapamycin处理组中18.28 μg/L浓度组LC3-Ⅱ表达水平明显高于其他各浓度组(F =375.120,P＜0.01),而p62表达水平却明显低于其他浓度组(F=70.770,P＜0.01).PI染色检测结果显示,20.60mg/L CDP组及18.28μg/L rapamycin组的细胞凋亡率与对照组间无明显差异(F=0.371,P=0.705).结论 二磷酸氯喹可以抑制CNE-2细胞的自噬功能,且在20.60mg/L浓度时抑制功能最显著,而不引起细胞凋亡;雷帕霉素可以诱导CNE-2细胞发生自噬,且在18.28μg/L浓度时自噬现象最为明显,而不影响细胞增殖.     

840例鼻咽癌预后的多因素分析

目的：探讨鼻咽癌放射治疗预后的影响因素，为规范鼻咽癌放射治疗提供参考。方法：对1996年1月至2001年12月在本院接受放疗的840例鼻咽癌病例进行回顾性分析。采用Kaplan—Meier法计算鼻咽局部控制率、无瘤生存率及总生存率，差别显著性检验采用Log—rank法，Cox回归模型分析影响预后的因素。结果：1）全组3、5、10年鼻咽局部控制率分别为70．6％、56．7％和36．6％，无瘤生存率分别为66．8％、51．8％和32，0％，总生存率分别为7318％、58．6％和39．4％；2）单因素分析结果显示性别、年龄、临床分期、T分期、N分期、有无颅底侵犯、有无颅神经侵犯、有无副鼻窦侵犯、有无颈部淋巴结转移、单侧／双侧颈部淋巴结转移、颈部转移淋巴结的部位、鼻咽腔内后装近距离治疗、外照射分割方式、有无化疗等因素对鼻咽局部控制率、无瘤生存率及总生存率的影响有显著性差异（P=0．00或〈0．05），鼻咽部照射剂量对鼻咽局部控制率、总生存率的影响有显著性差异（P〈0．05），颈动脉鞘区侵犯者无瘤生存率低于无侵犯者（P〈0.05），但不影响鼻咽局部控制率及总生存率（P〉0．05）；3）多因素分析结果显示性别、年龄、临床分期、T分期、单侧，双侧颈部淋巴结转移、鼻咽腔内后装近距离治疗是影响鼻咽部局部控制率、无瘤生存率及总生存率的独立预后因素；4）分层分析结果显示T2-T3期辅助高剂量率腔内后装近距离治疗的患者鼻咽局部控制率、无瘤生存率及总生存率均显著高于不加腔内治疗者（P〈0．01～0．05），而T1、T4期患者外照射后加用高剂量率腔内后装近距离治疗并未提高其鼻咽局部控制率、无瘤生存率及总生存率（P〉0．05）。结论：鼻咽癌临床分期（特别是T分期）晚期和，或双侧颈部淋巴结转移和，或男性患者预后不佳，在外照射的基础上加用鼻咽腔内后装放疗可改善T2-T3期患者的预后。     

放疗联合不同同步化疗方案治疗局部晚期鼻咽癌的毒副反应及远期疗效比较

目的：：对比单药顺铂及顺铂联合5-Fu 同步放化疗治疗局部晚期鼻咽癌患者的毒副反应及远期疗效。方法：选取2005年1月至2011年12月共140例局部晚期鼻咽癌患者参与本研究,临床分期均为Ⅲ～Ⅳb 期。单药顺铂组（DDP 组）70例、顺铂联合5-Fu 组（PF 组）70例,两组均采用根治性常规分割放疗,DDP 组同步化疗方案：顺铂80～100mg／m2静滴,分3天用,每3周1次,共1～3个周期;PF 组为：顺铂80 mg／m2,静滴,分3天用,5-Fu 750 mg／m2／d,静滴,d1～d4,每3周1次,共1～3个周期。比较两组的远期疗效及毒副反应。结果：中位随访时间55个月,DDP 组和 PF 组5年总生存率、无局部区域复发生存率、无远处转移生存率及无病生存率分别为71.7％vs.64.0％（P ＝0.62）、91.8％ vs.85.7％（P ＝0.13）、86.7％ vs.85.2％（P ＝0.95）及80.6％ vs.78.8％（P ＝0.65）。多因素统计分析显示,年龄、N 分期是影响5年总生存率的独立预后因素（HR,1.99;95％ CI,1.15～3.46;P ＝0.01）、（HR,2.01;95％ CI,1.06～4.15;P ＝0.03）。两组毒副反应以口腔黏膜炎、恶心呕吐及白细胞减少为主,但 PF 组出现口腔黏膜炎的患者较 DDP 组多,差异有统计学意义（P ＜0.05）DDP 组的顺应性优于 PF 组,两组均未出现治疗相关性死亡,但化疗周期完成数≥2周期的患者 DDP 组有52例（74.3％）,PF 组仅25例（35.7％）。结论：对局部晚期鼻咽癌患者,单药顺铂与顺铂联合5-Fu 两种同步化疗方案远期疗效相近,患者大都可耐受,但口腔黏膜炎 PF 组较 DDP 组重。     

c-jun基因沉默对放射抗拒鼻咽癌裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响

目的 探讨c-jun基因沉默对人鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响。方法 用携带shRAN慢病毒载体感染CNE-2R细胞以沉默c-jun基因,构建c-jun-shRNA-CNE-2R细胞组（c-jun-shRNA组）以及阴性对照NC-shRNA-CNE-2R细胞组（NC组）,以CNE-2R细胞为空白对照组,采用Western blot 检测3组细胞中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白的表达水平。构建裸鼠模型,观察3组细胞裸鼠皮下种植瘤生长曲线及体积;采用免疫组化法检测移植瘤组织中VEGF、CD34的表达,并检测组织内微血管密度（microvessel density,MVD）。结果 Western blot 结果显示,c-jun-shRNA组细胞VEGF蛋白表达较NC组及空白对照组明显下调（P<0.05）。裸鼠模型实验中,c-jun-shRNA组移植瘤体积为（720.85±72.10） mm³,质量为（0.42±0.04）g,MVD为11.69±3.30;NC组移植瘤体积为（1 196.81±90.69） mm³,质量为（0.80±0.08）g,MVD为32.56±7.33;空白对照组移植瘤体积为（1 203.76±100.42） mm³,质量为（0.83±0.05）g,MVD为35.45±4.87;c-jun-shRNA组种植瘤体积、质量、MVD较NC组和空白对照组低（P<0.05）。免疫组化检测结果显示,移植瘤组织中VEGF蛋白表达c-jun-shRNA组呈弱阳性,NC组及空白对照组组均呈强阳性。结论 c- jun基因沉默可抑制放射抗拒性鼻咽癌移植瘤生长及血管生成。     

人鼻咽癌放射抗拒细胞株建立及其细胞周期的观察

-2R的存活率大于CNE-2(89.0% vs 71.7%),P=0.001;细胞分布周期改变,CNE-2R的S期比例增高,G0/G1和G2/M期细胞减少,χ2=7.312,P=0.034; CNE-2R在照射后12～36 h出现明显的G2/M期阻滞,亲本CNE-2仅在照射后12～24 h G2/M期略有增加.结论:人鼻咽癌细胞株CNE-2经间歇性大剂量γ射线多次照射后得到的CNE-2R具有稳定放射抗拒性,并且显示出与亲代不同的细胞周期特征.