幽门螺杆菌尿毒酶B基因的克隆与高效表达

目的 克隆并表达幽门螺杆菌尿素酶B基因。方法 提取幽门螺杆菌染色体DNA，用PCR方法扩增尿素酶B基因。将其克隆至表达载体pQE30,转化大肠杆菌M15，IPTG诱导表达。结果 分离得到了1．7kb的 ureB基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达。在37℃诱导表达4h后，表达产物约占细菌总蛋白的34．0％，表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在，其中主要是包涵体的形式，目的蛋白占不溶性蛋白的55．8％。结论 幽门螺杆菌ureB基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础。     

幽门螺杆菌过氧化氢酶基因的克隆、高效表达及活性评价

目的：构建高效表达幽门螺杆菌（Hp）过氧化氢酶重组蛋白的候选菌株并测定其活性。方法：用PCR方法从Hp染色体DNA上扩增过氧化氢酶基因，将其定向插入表达pET-22b(＋），并在BL21（DE3）大肠杆菌中表达，进一步利用贝尔斯－西策尔斯法测定其活性。结果：DNA序列分析表明，所克隆的过氧化氢酶基因序列与基因库公布的一致。在37℃诱导表达3h后，过氧化氢酶重组蛋白表达量占苗体总蛋白的24．4％，并显示了良好的活性。结论：本研究获得了表达高活性Hp过氧化氢酶的克隆，为深入研究其相关功能奠定了良好基因。     

肠毒素大肠杆菌攻毒小鼠模型的建立以及疫苗候选株保护效果的评价

目的:建立肠毒素大肠杆菌攻毒小鼠模型以及应用模型对疫苗候选株免疫效果进行评价．方法:通过鼻饲半数致死量(LD50)肠毒素大肠杆菌E44813,E44815和E11881A观察小鼠肺病理学变化、肺部细菌清除情况变化,建立肠毒素大肠杆菌鼻饲小鼠模型;应用鼻饲小鼠模型观察疫苗候选株FE1,FE3,FE6保护效果．结果:鼻饲LD50剂量肠毒素大肠杆菌小鼠的病理特征是肺组织存在大量的淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和浆细胞,为多病灶支气管肺炎,肺部细菌清除缓慢,至第7天仍能检测到105数量级的细菌．应用疫苗候选株免疫后进行攻毒,小鼠没有发病和死亡,病理特征主要是淋巴细胞少量增多,肺部细菌清除迅速,至第7天已检测不到细菌,与对照有显著性差异(0 CFU／g vs 6．2×105,5．4×105,2．3×105 CFU／g,P<0．05)．结论:肠毒素大肠杆菌鼻饲小鼠模型能够为疫苗筛选和评价提供了有效途径,同时也证实了疫苗候选株FE1,FE3,FE6具有良好的免疫保护效果．     

幽门螺杆菌4种黏附素基因保守区的克隆、序列及其生物信息学分析

目的克隆幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)4种黏附素(BabA、AlpA、AlpB和HopZ)的保守区,并对其进行序列及生物信息学分析,为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供实验基础。方法利用ANTHEPROT V4.3c 软件分析已证实的Hp4种黏附素蛋白序列,发现共同保守区(命名为CB),推导出其DNA序列,设计CB特异引物,将PCR产物定向插入pET-22b(+)载体,构建保守区的重组克隆。DNA自动分析仪进行序列测定,生物信息学软件对其生物学特性进行分析。结果构建了4种黏附素共同保守区的重组质粒,测序显示CB基因长588 bp,该基因编码195个氨基酸,与4种黏附素保守区的同源性均达50%以上,ANTHEPROT V4.3c软件预测其蛋白质相对分子质量约为22 500,并显示出了良好的抗原性和疏水性。BLAST分析了836 767个序列,与其同源性达40%的均为Hp序列。结论Hp4种黏附素存在同源性接近的保守区,表明其黏附作用可能有相似的分子基础,生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性和严格的种属特异性。     

幽门螺杆菌粘附素AlpA基因克隆、表达及免疫原性研究

目的 构建表达幽门螺杆菌(Hp)黏附素AlpA的候选菌株并研究其免疫原性。方法 利用PCR技术扩增粘附素AlpA基因，将其定向插入pET-22b( )载体，在BL21(DE3)大肠杆菌中表达并通过免疫印迹实验研究其免疫原性。结果 克隆的粘附素AlpA基因序列与基因库公布的基本一致，粘附素AlpA重组蛋白表达量占菌体总蛋白的31．9％，经免疫印迹证实该重组蛋白可被AlpA免疫兔血清和Hp,感染患者血清所识别。结论．AlpA克隆、高效表达及其免疫原性的初步证实，为Hp基因工程疫苗的研制和粘附机制的研究打下了基础。     

幽门螺杆菌长期感染蒙古沙土鼠导致胃炎、胃溃疡的实验研究

目的：用幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)长期感染蒙古沙土鼠建立胃炎、胃溃疡的动物模型。方法：蒙古沙土鼠经过禁食、禁水预处理之后，采用国际标准菌株H.pylori ATCC 43504灌胃，在末次灌胃动物后4，8，12，24，48，52周分别对H.pylori感染组和正常对照组蒙古沙土鼠的胃黏膜进行H.pylori形态学(涂片和细菌培养)、H.pylori快速尿素酶检测、H.pylori特异性PCR检测和病理组织学观察，并对血清中抗H.pylori IgG抗体进行了检测。结果：H.pylori感染组动物以上各项指标均为阳性，表明已经感染H.pylori；而正常对照组则以上各项均为阴性。病理组织学观察表明感染组8周即可见到慢性炎症性病变，12周时黏膜层和黏膜下层可见到淋巴滤泡，24周胃窦部可见到胃溃疡。结论：H.pylori ATCC 43504可以长期定植于蒙古沙土鼠腺胃，能够产生与H.pylori感染人胃黏膜相似的病理改变。     

肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原CS6和霍乱毒素B亚基在人伤寒沙门菌中的共表达及其免疫学效果观察

目的：构建表达肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原基因CS6和霍乱毒素B亚基（CTB）基因的细菌性腹泻基因工程多价疫苗。方法：以基因工程减毒的人伤寒沙门菌为抗原载体，利用基于asd基因功能互补的宿主染色体－质粒平衡致死表达系统，实现了在没有抗生素选择压力的条件下，CS6和CTB在人伤寒沙门菌中的稳定表达。结果与结论：检测结果表达，CS6和CTB的表达虽对宿主菌的生长有一定影响。但经过一段时间的培养，重组菌株仍可达到高密度生长，动物免疫结果显示，重组菌株在家兔体内均可诱生相应抗体，但从诱生的抗体效价，抗体持续时间方面评价，单独表达CS6与CTB的重组菌株的免疫学效果均好于两者共表达的重组菌株，提示在以后的疫苗研究实践中，可以考虑将分别表达CS6和CTB的重组菌株按一定比例混合，组成联合疫苗，用于细菌性腹泻的的免疫预防，本研究结果对于细菌性腹泻基因工程多价疫苗的构建有指导意义。     

HeLa细胞中细胞周期蛋白B不降解也能完成有丝分裂中后期转变

目的：在用细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ）Ｂ１作为ＨｅＬａ细胞周期Ｇ１期时相的阴性标志物时，发现呈阳性结果，为此，对细胞周期蛋白Ｂ在细胞的Ｍ期向Ｇ１期过渡中的作用做进一步探讨。方法：分别用诺考达唑（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）和离心淘洗的方法同步化ＨｅＬａ细胞，用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹方法检测细胞周期蛋白Ｂ的存在。结果：用诺考达唑阻断细胞于Ｍ期，然后释放４ｈ所得的Ｇ１期细胞中有细胞周期蛋白Ｂ，而离心淘洗的方法所得Ｇ１期细胞中没有细胞周期蛋白Ｂ。结论：（１）诺考达唑阻断细胞于Ｍ期后，可影响细胞周期蛋白Ｂ１在Ｍ期后期的降解；（２）细胞周期蛋白Ｂ１的降解对于ＨｅＬａ细胞由Ｍ期向Ｇ１期过渡并不是必需的，可能还有别的蛋白质参与；（３）采用药物阻断的方法同步化细胞，对细胞的生理、生化活动有潜在的影响。     

ET重组:Escherichia coli中最新分子克隆方法

功能基因组研究的飞速发展推动了在E .coli中运用体内同源重组的方法进行DNA操作的技术革新步伐 ,ET体内重组方法具有应用范围广、操作灵活简便、重组效率高等优点 ,它可进行常规分子生物学无法实现的操作。这种方法不依赖于合适的限制酶切位点 ,能够在靶分子的任意位置上进行基因的插入、缺失和替换 ;能够直接进行亚克隆并且还可以从细菌人工染色体和基因组DNA片段中克隆所需DNA。本文所阐述的方法可应用于包括长DNA在内的任意大小DNA的修饰 ,并概括描述了基因调控研究的最新策略