胎儿海马神经干细胞的体外培养及神经元前体细胞的纯化

目的　从人胎儿海马分离培养具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞 ,并从中纯化神经元前体细胞。　方法　利用无血清培养从胚胎 4个月的胎儿海马区分离细胞 ,并在体外连续传代培养 ;采用免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白 (nestin)的表达、经BrdU孵育后的BrdU表达 ;比较两种诱导分化方法所获得的神经元和胶质细胞的比例差异 ;利用单细胞克隆技术纯化神经元前体细胞。　结果　分离的细胞具有连续克隆能力 ,在体外培养了 16个月 ,传了 4 3代 ;细胞冻存、复苏后仍保持干细胞特性 ;培养的细胞呈Nestin阳性 ,在BrdU孵育后呈BrdU阳性 ,诱导分化后的细胞能够表达Tubulin、NeuN或GFAP ;利用无血清诱导所得到的分化细胞中神经元的比例约占 80 % ,而血清诱导的分化细胞中胶质细胞的比例则大于 90 %。利用单细胞克隆技术可从神经球中纯化的细胞表达Nestin ,并且全部分化成神经元。　结论　从胎儿海马区分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能 ,属于神经干细胞 ,从中可纯化出神经元前体细胞     

植入PHPMA水凝胶对脑损伤后胶质瘢痕形成的抑制性影响

人工合成 PHPMA水凝胶材料。利用此材料修补急性损伤的大鼠脑皮质缺损区 ,评价其对创伤后胶质瘢痕形成的影响以及在神经组织再生中的作用。合成的水凝胶材料经检测分析性状后植入预先造成的大脑皮质空腔内 ,4周以后灌注取脑 ,观察植入材料和周围组织整合结果以及星形胶质细胞在材料周围和内部的浸润状况 ,确定有无胶质瘢痕的形成 ,并进行超微结构分析。结果表明 ,植入材料可和周围组织良好整合 ,二者交界处细胞分布弥散 ,星形胶质细胞无过度聚集现象 ;植入材料内部有轴突样结构生长和血管发生。本研究结果提示 ,利用 PHPMA水凝胶填补脑损伤后的空洞可抑制胶质瘢痕的形成 ,有利于损伤部位神经组织的再生。     

接枝Nogo-A抗体和多聚赖氨酸的透明质酸水凝胶支架的制备及其与培养海马神经元相容性的研究

为探讨同时接枝Nogo-A受体(NgR)的抗体和多聚赖氨酸(PLL)的透明质酸(HA)水凝胶用于中枢神经系统损伤修复的可行性,本研究在碳二亚胺盐酸盐的介导下用己二酸二酰肼交联的方法制备HA水凝胶,并接枝PLL和NgR抗体。取新生大鼠海马神经元接种于水凝胶支架材料上,分为HA-NgR抗体-PLL水凝胶组和纯HA水凝胶组。培养7d后,用吖啶橙(AO)染色、抗神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色和扫描电镜观察两组细胞的生长情况。结果显示:纯HA水凝胶不利于神经细胞在材料上粘附和突起生长;HA-NgR抗体-PLL水凝胶可以显著增加海马神经元的粘附数量、促进神经元突起形成,同时也能使星形胶质细胞在材料表面生长。上述结果提示:接枝NgR抗体和PLL的HA水凝胶与海马神经元相容性良好,为中枢神经系统损伤修复提供了一种较理想的支架材料。     

帕金森病大鼠黑质和纹状体神经元的变化

本研究采用免疫细胞化学方法观察了由６－ＯＨＤＡ单侧微量注射制成的帕金森病大鼠黑质酪氨酸羟化酶样（多巴胺能）神经元及其纤维和纹状体头部Ｐ物质神经元及体部ＧＡＢＡ能神经元的变化，以进一步揭示黑质、纹状体间的功能联系。结果显示，６－ＯＨＤＡ注射侧黑质酪氨酸羟化酶样神经元及其纤维显著减少，注射侧纹状体面积、纹状体Ｐ物质神经元和ＧＡＢＡ能神经元数量均较正常对照侧明显减少。本研究表明黑质多巴胺能神经元的损毁，破坏了黑质纹状体间正常的递质运送，进而导致纹状体的改变。     

周围神经的损伤与修复

目前临床诊断周围神经损伤的依据是Seddon和Sunderland分类 ,而治疗周围神经损伤主要是通过各种方法模拟损伤后再生的病理生理过程。如需消除张力 ,应采用端端吻合修复 ;自体神经移植仍然是临床治疗长距离损伤的重要手段 ;当不能采用自体神经移植时 ,可以应用同种异体神经移植或自体组织移植 ;可生物降解、人工合成的神经导管在实验中表现出广阔的应用前景     

大鼠脊髓小脑前束起始细胞——脊髓边缘细胞突触形态学的电镜研究

将辣根过氧化物酶注入大鼠小脑后,在脊髓L_1～L_3节段中的脊髓边缘细胞(SBC)得到逆行标记。对标记的SBC的突触联系进行电镜观察,并根据突触前区小泡形状及终扣形态,将这些终扣大致可分为6型,即S、F、Cf、T、G和P型。其中S和F型终扣根据其形态,各自又分为两个亚型,即细长型和圆型。S和F型分别含有球形及扁平型小泡;Cf型终扣含扁形小泡,突触前、后膜无明显特征,在突触后膜下有亚突触间隙;T型终扣含有清亮球形小泡,也可见大颗粒小泡,在突触后膜下可见致密体;G型终扣在突触前区内含有大颗粒小泡;P型是指附着在大S型终扣上的含有多样形小泡的终扣。S型、T型和G型突触后膜均比前膜明显增厚,呈不对称性。有关上述SBC突触终扣来源问题,还需进一步研究。     

低氧预适应小鼠脑内ERK1/2磷酸化水平和蛋白表达量的改变

目的：初步探讨细胞外信号调节激酶（Extraeellular signal-regulated kinases，ERK1／2）在脑低氧预适应发生发展过程中的作用。方法：按已建小鼠整体低氧预适应模型，将BALB／C小鼠（18-22g，雌雄不限）随机分为正常对照（H0）、早期（H1-H4）和延迟性（U5-H6）低氧预适应等7组（每组至少6只动物）。应用SDS-PAGE和Western blot等生化技术，并结合Gel Doc凝胶成像系统，半定量检测小鼠脑组织内ERK1／2的磷酸化水平和蛋白表达量。结果：①早期低氧预适应形成过程中，随低氧暴露次数的增加（H1-H4），小鼠海马和皮层组织内ERK1／2磷酸化水平显著降低（P〈0．05，n=6），而ERK1／2蛋白表达量并无显著变化；②延迟性低氧预适应中（H5-H6），小鼠大脑皮层和海马组织内ERK1／2的蛋白表达量显著降低（P〈0．05，n=6）。结论：ERK1／2的活性降低（磷酸化水平降低），以及ERK1／2蛋白表达量下调可能分别参与了脑早期低氧预适应和晚期延迟性低氧预适应的发生发展过程。     

逆转录病毒载体ex vivo途径表达TH和GDNF基因

为了通过逆转录病毒载体 ex vivo途径高效表达 TH和 GDNF基因。本实验构建有 TH和 GDNF基因的重组逆转录病毒载体 p LHCX/TH和 p L NCX2 /GDNF,分别转染包装细胞 PA3 17和 PT67中 ;经筛选、RT-PCR、免疫组化等鉴定得到产毒细胞 PA3 17/TH和 PT67/GDNF。培养 COS-7细胞 ,以两种产毒细胞的上清分别感染 COS-7细胞 ,筛选后 ,免疫组化、原位杂交检测基因的表达量 ,将基因改造的细胞移植到大鼠纹状体内 ,免疫组化检测体内移植的 TH、GDNF基因的表达。结果表明 :TH和GDNF基因可在靶细胞表达 ,且筛选后基因表达阳性细胞显著增加 ;TH阳性率达 5 0 % ,GDNF阳性率达 70 %。在体内实验中 ,可以观察到这两种外源基因可同时在大鼠脑内移植区表达。以上结果提示 ,TH和 GDNF基因改造细胞 ,可通过 ex vivo途径在脑内移植区高效表达。这一实验结果将对 Parkinson病复合性基因治疗提供依据     

运用HRP逆行追踪法对家兔脊髓小脑束起始细胞的研究

本文在11只家兔小脑内,进行单侧或双侧辣根过氧化物酶注射,以研究脊髓各部标记神经元的分布。同时,为确定胸髓以下这些神经元轴突是否在脊髓内交叉上行,其中4只家兔在注射前,还作了下胸髓的一侧半断。标记的脊髓小脑束起始细胞在脊髓中分布甚广。位于颈髓的有:1.中央颈核(C_(1～4));2.Ⅵ层内侧部细胞(C_2～T_1);3.Ⅶ层中央部细胞(C_(4～8));4.后角Ⅳ～V层细胞(C_(5～8))。胸髓以下的标记细胞可分两大类:1.具有不交叉上行轴突的细胞为:(1)背核(T_(2～L_4));(2)后角Ⅳ～Ⅵ层细胞(T_2～L_6)。2.具有交叉越边上行轴突的细胞则包括:(1)脊髓前角边缘细胞(L_(3～6));(2)Ⅶ层内侧群细胞(L_5以下骶尾髓);(3)后角V层细胞(骶尾髓);(4)前角Ⅶ～Ⅷ层细胞(骶尾髓)。家兔脊髓小脑束起始细胞的分布和轴突投射特点,与猫相类似。这对进一步用家兔研究脊髓小脑系统的解剖学和生理学打下一定基础。     

胰岛素样生长因子-1 工程细胞在糖尿病中的治疗作用

目的 观察胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)工程细胞移植对糖尿病模型鼠的降血糖作用.方法 将hIGF-1基因克隆入pAAV腺病毒相关病毒载体,以HEK293包装细胞及病毒颗粒,HT1080细胞检测病毒滴度.将高病毒滴度的病毒上清感染骨髓基质细胞(MSCs)并植入糖尿病模型小鼠腹腔内,观察病毒感染MSCs植入对糖尿病模型小鼠血糖的影响.结果 成功构建了hIGF-1腺病毒相关病毒载体,HEK293细胞包装得到了1012滴度的病毒上清.MSCs病毒感染率达60%.稳定表达hIGF-1的MSCs腹腔移植后,可见糖尿病小鼠的血糖明显下降(P＜0.05).结论 稳定表达hIGF-1的MSCs对糖尿病动物模型有降糖作用,说明IGF-1基因可作为糖尿病基因治疗的候选基因.