HPV58 E6体外降解p53蛋白作用的研究

通过PCR方法从有乳头瘤病毒58型（HPV58）全基因克隆中扩增出HPV58E6基因片段，克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游，并在体外转录成mRNA后，在源自网织红细胞的翻译缓冲液中成功表达了含有生物素标记的HPV58E6蛋白，并在体外成功发现HPV58E6能够降解p53蛋白，从而推断结合并降解p53蛋白是其致癌作用的关键环节，这为日后在细胞内对其致癌机理行进一步研究以及针对其进行治疗奠定下坚实的基础。     

HCMV pp65和gB联合核酸疫苗表达载体的构建及其体内生物学活性研究

人巨细胞病毒(HCMV)主要被膜磷蛋白pp65(phosphoprotein 65)及糖蛋白gB(glycoprotein B)在病毒感染及诱发机体免疫反应中起重要作用，近年来有不少学者对HCMV pp65和gB这两种抗原进行动物和临床试验研究，虽取得了一定效果，但仍存在免疫原性弱、免疫范围局限等缺点。本研究利用分子生物学方法将HCMV两种保护性免疫原性基因pp65和gB构建在一起，制备HCMV核酸疫苗，并研究其在小鼠体内的免疫活性。     

HPV16 L1-E7c嵌合基因的重组杆状病毒在昆虫细胞中表达及免疫小鼠的效应研究

目前,关于人乳头瘤病毒疫苗的研究主要集中在嵌合型病毒样颗粒(cVLP)上。本研究制备了昆虫细胞表达的HPV16L1E7cCVLP,并将该蛋白疫苗接种动物,探讨其诱发体液免疫应答和细胞因子的效应。1材料和方法酶切pUC19L1E7c获得L1E7c基因,与杆状病毒转移载体pFastBac1连接,转化DH10Bac菌。PCR扩增L1E7c鉴定重组质粒。BacmidDNA与Cellfectin混合,转染SF9细胞,培养3～6d。进行15%SDS PAGE电泳和WesternBlot,兔抗HPV16L1和E7抗体由美国Galloway教授惠赠。HPV16L1-E7cVLP纯化后做为疫苗。选择6～8周龄BALB/c小鼠,每组6只。第1组…     

小鼠对HPV16L1-E7重组腺病毒和重组质粒的免疫应答

对比研究人乳头瘤病毒16型L1-E7重组腺病毒(rAd5HPV16L1-E7)和重组质粒经不同途径免疫小鼠所产生的免疫效应.将rAd5HPV16L1-E7病毒在293细胞中扩增,并制备rAd5HPV16L1-E7重组质粒,分别以肌肉注射、滴鼻途径免疫小鼠,采用ELISA法测其血清IgG抗体水平;制备脾细胞悬液,加入到96孔无菌培养板中,分别加入rAd5HPV16L1-E7特异性蛋白和10%FCS RPMI1640,加入3H-TdR 1μCi/孔,做T-细胞增殖实验;取经过培养56 h的培养液进行IFN-γ的测定.不同疫苗和不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组小鼠(P＜0.05),IFN-γ和T-细胞增殖亦高于对照组(P＜0.05),且各实验组中病毒特异性蛋白刺激组均高于非刺激组(P＜0.05).提示rAd5HPV16L1-E7重组质粒和rAd5HPV16L1-E7重组活病毒一样既能刺激T-细胞产生细胞免疫应答,又能刺激B-细胞产生体液免疫应答,说明其具有很好的免疫原性,是一种很有发展前景的防治疫苗.     

HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的获得足够量的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1融合蛋白及含HPV16L1ORF序列的基因重组体。方法通过PCR扩增获得HPV16L1基因片段,将此片段插入原核细胞表达载体pGEMEX-1,构建相应的重组表达质粒pGEMEX-L1,将此质粒转化大肠杆菌JMl09(DE3),得到的转化子经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Western blotting免疫印迹分析。结果HPV16L1基因重组体构建成功,克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Western blotting检测中具有和抗HPV16L1阳性血清反应的抗原性。结论HPV16L1基因片段可在大肠杆菌中得到有效表达,表达产物可与相应的抗血清发生阳性反应。     

HPV_(16)L1-E7重组病毒及其重组质粒免疫后小鼠抗体水平动态变化的研究

目的 :研究人乳头瘤病毒 16型L1 E7重组腺病毒 (rAd5HPV16 L1 E7virus)及其重组质粒 (rAd5HPV16 L1 E7plasmid)经不同途径免疫后小鼠抗体水平的动态变化。方法 :用 2 93细胞扩增rAd5HPV16 L1 E7重组病毒 ,同时制备rAd5HPV16 L1 E7重组质粒 ,分别以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠 ,采用ELISA法测定其血清IgG抗体水平。结果 :rAd5HPV16 L1 E7重组病毒及其重组质粒采用不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,其中以肌注组产生抗体量最多 ,并且出现最早。结论 :rAd5HPV16 L1 E7重组病毒及其重组质粒均能刺激B细胞产生抗体介导的免疫应答 ,免疫途径不同 ,抗体峰值的出现时间亦不同 ,测定抗体的最佳时间亦不同。     

利用厌氧菌突破肿瘤放化疗抵抗的研究进展

肿瘤内部乏氧区的存在降低了放化疗的治疗效果，因此成为肿瘤的防线，而厌氧菌凭借其自身的特性成为可能突破这一防线的中坚力量。现综述有关厌氧菌的肿瘤靶向性及其抗瘤作用的研究进展、主要作用机制、与其他手段的联合应用及其在影像学诊断中的应用前景。     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＥＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射生标记制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶ ＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｍｇ ＨＣＭＶ ＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。     

沙眼衣原体感染对树突状细胞功能的影响

目的：探讨鼠型沙眼衣原体(Chlamydia muridarum，C.muridarum）在树突状细胞（Dendritic Cell，DC）内的存活情况以及对DC功能的影响，为衣原体致病机制的研究提供实验依据。方法：诱导培养BALB/c小鼠骨髓来源的DC。用C.muridarum感染DC，分别在24、72h固定细胞进行衣原体包涵体染色；采用ELISA方法检测感染DC上清中的细胞因子；感染DC与T细胞共孵育48h, CCK-8检测T细胞增殖。结果：C.muridarum能够感染骨髓来源DC，衣原体在DC中生长缓慢，形成非典型的包涵体；感染后的DC分泌较高水平的IL-12和低水平的IL-10;并且能够刺激T细胞增殖，说明衣原体感染的DC仍然具有抗原递呈能力。结论：成功建立C.muridarum感染DC的体外细胞模型，且沙眼衣原体感染对DC抗原递呈功能没有造成明显影响。     

人乳头瘤病毒16型野毒株L1-E7融合基因重组腺病毒载体构建及在293细胞中表达嵌合病毒样颗粒的研究

目的制备人乳头瘤病毒HPV16L1-E7重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的重组腺病毒减毒活疫苗。方法以HPV16型的野毒株HPV16-114/K为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16L1-E7融合基因pUC19L1-E7,含L1的1～301氨基酸（AA）和E7的1～60AA的编码DNA序列;并转入腺病毒穿梭质粒pCA14L1-E7,与腺病毒质粒pBHG10共转染293细胞,筛选重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7。以PCR、ELISA和Westernblot方法鉴定重组病毒及其表达的L1-E7蛋白,密度梯度超速离心纯化HPV16嵌合L1-E7VLP,电镜观察VLP的形态结构。结果PCR-DNA序列分析表明成功构建了HPV16L1-E7重组质粒pUC19L1-E7;并获得HPV16重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7,在293细胞中可高效表达L1-E7蛋白,并形成嵌合病毒样颗粒（cVLP）。结论构建的重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7可有效表达HPV16L1-E7cVLP,可进一步用于动物实验,研究其在防治宫颈癌中的作用。