结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原？…

在重组分枝杆菌中表达编码人结核杆菌热休克蛋白的ＤｎａＫ基因，并观察其对小鼠的免疫效应。方法采用基因工程和免疫学技术将ＤｎａＫ基因及其两侧的表达调控区一起从质粒ＰＭＴ＿７０中切出，经末端修饰后装入大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒ＰＢＣＧ－２０００中，构建成新的重组粒ＰＢＣＧ－ＴＢ７０中切出     

人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。     

日本血吸虫菲律宾株26kDa抗原的表达、纯化与应用

利用亲和层析和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等分子生物学技术，表达、纯化、鉴定了重组日本血吸虫菲律宾株２６ｋＤａ抗原（ｒＳｊｐ２６ＧＳＴ），并比较了其与日本血吸虫大陆株２６ｋＤａ抗原（ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ）基因ｃＤＮＡ序列的异同，分析了其应用前景。分别以质粒ｐＧＥＸ和血吸虫大陆株总ＲＮＡ为模板，经ＰＣＲ或逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出的Ｓｊｐ２６ＧＳＴ和Ｓｊｃ２６ＧＳＴｃＤＮＡ，其片段长度均为６５４ｂｐ。通过双脱氧测序结果显示两者碱基排列顺序相同。用大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）表达载体在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达Ｓｊｐ２６ＧＳＴ，ｒＳｊｐ２６ＧＳＴ占菌体总蛋白的２５％。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析柱一步纯化法，得到纯品Ｓｊｐ２６ＧＳＴ，将其作为靶抗原用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测血吸虫大陆株感染者和感染小鼠血清及用Ｓｊｃ２６ＧＳＴ免疫的小鼠血清，反应均为阳性。本研究提示Ｓｊｐ２６ＧＳＴ与Ｓｊｃ２６ＧＳＴ在ＤＮＡ序列、氨基酸顺序和抗原性等方面高度同源，Ｓｊｐ２６ＧＳＴ在研制日本血吸虫疫苗方面具有一定应用价值     

人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定

目的　构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法　用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5。利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中 ,经热诱导后 ,用SDS PAG电泳来观察其表达水平。利用Westernblot来检验HSP6 5的生物学活性。结果　酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明 ,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白 6 5DNA片段与报道结果完全一致 ,重组体的连接方向正确 ,阅读框与预期完全一致。热诱导后 ,重组BCG表达的 6 5kD (1kD =0 992 1ku)蛋白占菌体总蛋白的 35 6 7% ,占裂解物上清总蛋白的 74 0 9% ,表明重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP6 5的抗体特异性结合。结论　成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5 ,重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的HSP6 5具有生物学活性 ,重组BCG疫苗构建成功。     

结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究

目的在重组分枝杆菌中表达编码人结核杆菌（ＴＢ）热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）的ＤｎａＫ基因，并观察其对小鼠的免疫效应。方法采用基因工程和免疫学技术将ＤｎａＫ基因及其两侧的表达调控区一起从质粒ｐＭＴ－７０中切出，经末端修饰后装入大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中，构建成新的重组质粒ｐＢＣＧ－ＴＢ７０，并用以转化耻垢分枝杆菌及大肠杆菌，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的ＨＳＰ７０；以重组耻垢分枝杆菌分别经皮下及腹腔免疫小鼠，用淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力，以ＮＯ法检测巨噬细胞吞噬活性，并检测血清中特异性抗ＴＢＨＳＰ７０的抗体。结果ＴＢＨＳＰ７０能在分枝杆菌中表达，表达量占菌体总蛋白量的１０％，不能在大肠杆菌中表达；重组耻垢分枝杆菌以１０６ＣＦＵ的剂量经皮下免疫小鼠后，可使小鼠脾淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）和腹腔巨噬细胞吞噬活性增高（Ｐ＜０．０５），并能刺激机体产生特异性抗ＴＢＨＳＰ７０的抗体，腹腔免疫激发的抗体滴度较皮下免疫为低，而ＳＩ无明显改变。结论构建的表达质粒ｐＢＣＧ－ＴＢ７０能在耻垢分枝杆菌中表达ＨＳＰ７０，该重组菌具有较强的免疫原性。     

Effect of In Vivo and in Vitro Treatment with Arsenite on Rat Hepatic Mitochondrial and Microsomal Enzymes

ＥｆｆｅｃｔｏｆＩｎＶｉｖｏａｎｄｉｎＶｉｔｒｏＴｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＡｒｓｅｎｉｔｅｏｎＲａｔＨｅｐａｔｉｃＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｎｄＭｉｃｒｏｓｏｍａｌＥｎｚｙｍｅｓＣＨＥＮＧＪｉｚｈｏｎｇ（程继忠）；ＷＵＨｕｉｑｉｏｎｇ（邬惠琼）；Ｓ...     

硒多糖,亚硒酸钠对大鼠肝线粒体酶的影响及其拮抗亚砷酸…

采用体内、体外实验方法研究了硒化合物和亚砷酸钠对大鼠肝线粒体丙酮的酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性以及对肝线粒体膜脂质过氧化，还原型谷胱甘肽含量的影响，探讨了其作用机理。     

质粒转化大肠杆菌方法的改进及受体菌转化效率的观察

质粒转化大肠杆菌方法的改进及受体菌转化效率的观察同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室，武汉４３００３０张慧，程继忠，李东，张桂梅，冯作化关键词质粒；转化，细菌；大肠杆菌中图法分类号Ｑ７５，Ｒ３７，Ｒ３７８．２＋１质粒转化大肠杆菌是分子生物...     

Construction and Expression of Bivalent Membrane-anchored DNA Vaccine Encoding Sj14FABP and Sj26GST Gene

In order to construct a eukaryotic co-expression plasmid containing membrane-anchored Sjc14FABP and Sjc26GST genes and identify their expression in vitro, Sj 14 and Sj26 genes were ob- tained by RT-PCR with total RNA of Schistosoma japonicum adult worms as the template and cloned into eukaryotic expression plasmid pVAC to construct recombinant plasmids pVAC-Sjl4 and pVAC-Sj26. Then a 23 amino-acid signal peptide of human interleukin-2 （IL-2） upstream Sj 14 or Sj26 gene and a membrane-anchored sequence containing 32 amino-acids of carboxyi-terminal of human placental alkaline phosphatase （PLAP） downstream were amplified by PCR as the template of plasmid pVAC-Sj14 or pVAC-Sj26 only to get two gene fragments including Sj14 gene and Sj26 gene. The two modified genes were altogether cloned into a eukaryotic co-expression plasmid plRES, resulting in another new recombinant plasmid plRES-Sj26-Sj14. The expression of Sj 14 and Sj26 genes was detected by RT-PCR and indirect immunofluorescent assays （IFA） when the plasmid plRES-Sj26-Sj 14 was transfected into eukaryotic Hela cells. Restriction enzyme analysis, PCR and sequencing results revealed that the recombinant plasmids pVAC-Sj14, pVAC-Sj26 and plRES-Sj26-Sj 14 were successfully constructed and the expression of modified Sj 14 and Sj26 genes could be detected by RT-PCR and IFA. A bivalent membrane-anchored DNA vaccine encoding Sj 14 and Sj26 genes was acquired and expressed proteins were proved to be mostly anchored in cellular membranes.