实时荧光定量PCR测定食管癌VEGF-C和VEGFR-3基因表达

目的建立测定血管内皮生长因子-C(VEGF-C)mRNA和血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)mRNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR),探讨其在食管癌组织及其癌旁组织中的表达水平。方法分别以自行构建和克隆的pMD18-VEGF-C和pMD18-VEGFR-3质粒作为定量模板,用循环阈值(Ct)定量起始的模板,在荧光TaqMan方法的基础上建立了测定VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的实时FQ-RT-PCR,并分别测定了40例食管癌组织及其癌旁组织中VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的表达水平。结果VEGF-CmRNA和VEGFR-3 mRNA测定的线性范围均为103~108拷贝/μg总RNA;VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA高、低值的批内、批间变异系数(CV)在7.07%~12.49%之间。VEGF-C mRNA主要表达在癌组织中,而VEGFR-3mRNA在癌组织与癌旁组织中表达无差异;VEGF-C mRNA与VEGFR-3 mRNA在癌组织与癌旁组织中表达存在相关性;24例淋巴结转移食管癌患者癌组织及其癌旁组织VEGF-C mRNA和V...     

聚肌苷酸胞苷酸对人肝癌细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用

目的 探讨聚肌苷酸胞苷酸(Poly I:C)对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721生长的增殖抑制和凋亡诱导作用,并探讨其作用机制.方法 肝癌SMMC-7721细胞经不同剂量Poly I:C作用后,CCK-8法检测细胞增殖抑制,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期变化,SYBR-Green荧光定量PCR检测TLR3、TRIF、IFN-βmRNA的表达.结果 Poly I:C 高剂量组的生长抑制率最高,高、中、低三个剂量组间比较差异有显著性(P<0.05).Poly I:C同一剂量组生长抑制率72 h最高,48 h次之,24 h时最低,每组不同时间点比较差异有显著性(P<0.05).流式细胞仪检测结果 显示Poly I:C可诱导SMMC-7721细胞凋亡,随浓度增加和时间的延长凋亡率逐渐升高(P<0.05).Poly I:C组细胞处于G1期的百分率明显高于对照组.TLR3、TRIF、IFN-βmRNA的表达均增高,三组间比较差异有显著性(P<0.05).结论 Poly I:C对体外培养的SMMC-7721有显著的增殖抑制作用,呈剂量依赖性和时间依赖性,其机制可能与细胞周期阻滞,TLR3通路激活,诱导产生IFN-β,诱导细胞凋亡有关.     

肾移植受者应用他克莫司治疗窗浓度的探讨

目的　寻求适合国人肾移植受者他克莫司 (FK5 0 6 )理想治疗窗浓度范围。方法　应用微粒子酶免疫分析法测定 5 8例肾移植患者口服FK5 0 6后 12h的血药谷浓度 ,并观察排斥反应的发生及药物的肾毒性。结果　FK5 0 6的血药浓度 ,术后 1个月为 (13.0± 2 .1) μg/L ,2～ 3个月为 (9.4±1.6 ) μg/L ,3个月以后为 (6 .5± 1.3) μg/L ,比较各时期全血FK5 0 6谷浓度 ,差异均有极显著性 (P <0 .0 1) ;术后发生急性排斥反应 3例次 ,肾毒性 4例次。结论　FK5 0 6具有良好的免疫抑制效果 ,其治疗窗浓度范围 ,术后第 1个月为 11～ 15 μg/L ,第 2～ 3个月为 8～ 11μg/L ;第 3个月后为 5～ 8μg/L ,此浓度范围既能达到满意的免疫抑制效果 ,又能减少FK5 0 6的肾毒性     

应用综合实验诊断M蛋白病

目的：应用免疫固定的电泳技术,提高Ｍ蛋白病的正确诊断率。方法：通过对血清免疫球蛋白定量、区带电泳、固定电泳以及尿的区带电泳、免疫电泳和本周氏蛋白的检测,综合分析判断。结果：检测来自国内送诊的１２１３例标本,共检出Ｍ蛋白４４５例,占３６．６９％,准确率达９９．６％。结论：以免疫固定电泳替代传统的检测方法,使得鉴定Ｍ蛋白的方法较２年前有了更大的提高。     

自身免疫性疾病噬菌体抗体库的构建和初步鉴定

目的构建系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）、强直性脊柱炎、干燥综合症（SS）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）等自身免疫性疾病的噬菌体抗体库。方法从多例确诊的高滴度自身免疫病患者外周血淋巴细胞中抽提总RNA,用RT—PCR方法分别扩增免疫球蛋白分子轻链κ、λ基因及重链Fd基因。经SacI和XbaI限制性双酶切后,在T4连接酶的作用下,将轻链基因片段克隆入同样双酶切的pComb3Hss载体中以构建轻链文库,随后将重链Fd段PCR产物经XhoI和SpeI双酶切后载入同样处理的κ/λpComb3Hss载体,然后将重组质粒κ/λ—Fd-pComb3Hss转化大肠杆菌XL1-Blue。用辅助噬菌体M13K07感染XL1-Blue,则可在噬菌体表面表达出随机的重组抗体库。结果提取的淋巴细胞总RNA及合成的cDNA质量好,PCR扩增了长度为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,成功构建了库容为4&#215;10^4的轻链抗体库和库容为6&#215;10^4的Fab片段噬菌体抗体库,酶切及PCR鉴定均正确无误。结论成功构建了自身免疫性疾病的噬菌体抗体库,为进-步筛选出高亲和力抗体打下了基础。     

VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA实时荧光定量检测方法的建立及初步应用

目的建立检测血管内皮生长因子-C（VEGF-C）mRNA和血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）mRNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（FO-RT-PCR）方法,并在食管癌组织中作初步应用。方法采用TaqMan荧光探针技术,分别以pMD18-VEGF-C和pMD18-VEGFR-3质粒作为定量模板,应用循环阈值（Ct）定量起始模板,建立检测食管癌组织的VEGF-CmRNA和VEG—FR-3tuRNA的实时FQ-RT-PCR方法。结果所建方法的线性范围：VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA均为10^3～10^8拷贝／μg总RNA;测定VEGF-C mRNA低值的批内、批间变异系数（CV）分别为7．07％和9．04％,测定VDGF-CmRNA高值的批内、批间CV分别为7．55％和10．28％;测定VEGFR-3mRNA低值的批内、批间CV分别为7．69％和12．49％,测定VEGFR-3mRNA高值的批内、批间CV分别为7．31％和9．17％。24例淋巴结转移食管癌患者癌组织VEGF-CmRNA和VEG—FR-3 mRNA的测定范围分别为3．69&#215;10^4～9．44&#215;10^6拷贝／μg总RNA和2．54&#215;10^4～8．03&#215;10^6拷贝／μg总RNA,均值分别为2．18&#215;10^6拷贝／μg总RNA和2．27&#215;10^6拷贝／μg总RNA。16例无淋巴结转移食管癌患者癌组织VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA的测定范围分别为2．32&#215;10^3～5．85&#215;10^5拷贝／μg总RNA和7．31&#215;10^2～8．21&#215;10^4拷贝／μg总RNA,均值分别为1．08&#215;10^5拷贝／μg总RNA和1．68&#215;10^4拷贝／μg总RNA。提示有淋巴结转移的食管癌组织VEGF-C和VEG—FR-3基因表达水平上调。结论本组建立的检测VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA的实时FQ-RT-PCR方法灵敏、准确、稳定、重复性好,可供VEGF-C、VEGFR-3基因表达的临床检测和研究应用。     

定量RT-PCR测定食管鳞癌组织中人叉头样转录因子3基因的表达

目的测定食管鳞状细胞癌组织中人叉头样转录因子3（forkhead box P3,FOXP3）的基因表达水平,为食管癌的免疫治疗提供依据。方法基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆载体pMD18-T—FOXP3,作为定量模板,建立检测FOXP3信使核糖核酸（mRNA）含量的实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法,在GeneAmp7500型检测仪上测定42例食管鳞癌组织和30例正常对照组织中FOXP3 mRNA的含量。结果食管鳞癌组织FOXP3 mRNA表达高于正常对照组织[（72．20±23．10）×10^4拷贝／μg RNAvs．（0．68±0．34）×10^4拷贝μgRNA;P〈0．053。结论成功建立了人FOXP3基因mRNA表达含量的荧光定量检测方法,FOXP3在食管鳞癌组织中的表达较正常对照组织增高。     

聚苯乙烯肽亲合标签和葡萄球菌蛋白A免疫球蛋白Fc结合区融合蛋白的克隆表达与应用

目的应用生物工程技术克隆、表达聚苯乙烯肽（PS）亲和标签（PStag）和葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫球蛋白（IgG）-Fc结合区（ZZ）融合蛋白,在大肠埃希菌BL21中进行高效表达并初步纯化,为优化、提升免疫检测方法奠定基础。方法应用基因合成技术串联SPA-ZZ结构域和PStag基因,构建重组表达质粒pPS-SPA,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫转印试验（Western blot）鉴定表达和纯化产物;直接酶联免疫吸附试验（ELISA）验证融合表达产物对亲水ELISA板的表面吸附特性和定向结合兔、鼠IgG-Fc区的效果。结果在合成基因的基础上构建的表达载体经序列分析与限制性酶切证实了串联基因的正确克隆,PAGE结果表明可诱导高表达PStag-SPA,纯化产物对亲水ELISA板的吸附能力较高,表达产物对兔与鼠IgG具有定向吸附能力。结论重组表达的PStag-SPA具有对ELISA板的黏着能力和定向结合兔、鼠IgG-Fc的应用潜力,为优化酶免疫检测技术提供了技术支持。     

强直性脊柱炎和类风湿关节炎患者低相对分子质量IgM水平的研究

目的 研究强直性脊柱炎(AS)和类风湿关节炎(RA)患者体内低相对分子质量IgM水平的变化.方法 取AS、RA患者和健康对照人群血清,超滤法分离低相对分子质量IgM,酶联免疫吸附试验测定低相对分子质量IgM比例.采用Mann-Whitney U检验方法进行统计分析.结果 AS和RA患者血清低相对分子质量IgM比例较健康对照明显升高(分别为0.194±0123,0.061±0.026,0.028±0.165);低相对分子质量IgM比例与患者病情活动度无明显相关.结论 低相对分子质量IgM升高可能是AS和RA患者体内体液免疫功能紊乱的表现,但其具体的病理意义尚需进一步研究.

Abstract：

Objective To study the serum levels of low molecule weight IgM (LMW IgM) in ankylosing spondylitis (AS) patients and rheumatoid arthritis (RA) patients and to evaluate the relationship of LMW IgM levels with the disease activities. Methods The levels of LMW IgM and pentameric IgM in AS patients, RA patients and healthy controls were measured with ELISA after separated using ultrafiltration assay. Differences in the percentage of LMW IgM between subject groups were analysed using Mann-Whitney U test. Results The percentages of LMW IgM increased dramatically in AS patients and RA patients compared with healthy controls (0.194 ± 0123, 0.061 ±0.026, 0.028 ±0.165 separately). The LMW IgM percentages were not correlated with the disease activities. Conclusion The increase of LMW IgM indicates humoral immune function abnormality in AS patients and RA. However, the mechanism needs further study.     

Her2／neu基因定量检测方法的建立

目的 建立人Her2/neu基因mRNA荧光定量检测方法 ,评价该方法 的准确性及稳定性.方法 基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆栽体pGEM-T-Her2/neu作为定量模板,通过荧光强度达到一定阈值时的循环数来定量起始模板,以建立实时荧光定量RT-PCR方法;并且在GeneAmp 5700型检测议上测定10例经免疫组织化学法证实Her2/neu表达卅的乳腺癌组织标本,同时对最大值及最小值重复测量.结果 Her2/neu动态检测范围为103～107拷贝/μg RNA(r≥0.996),内参β-actin的动态检测范围为103～108拷贝/μg RNA(r>0.998).10例检测癌组织的Her2/neu表达范围为6.6×104～4.7×106拷贝/μg,最大值10次重复测量值为(4.65±0.55)×106>拷贝/μg,最小值10次重复测量值为(7.36±0.75)×104拷贝/μg.结论 成功建立人Her2/neu基因表达RT-PCR检测方法 ,具有较高的准确性和稳定性,可用于检测Her2/neu基因表达水平,为进一步应用于乳腺癌预后判断及术后治疗方案的选择奠定了基础.