钩吻生物碱的提取分离及结构鉴定

中草药钩吻中具有抗癌活性生物碱单体成分的提取分离,并测定其结构。方法：药材粉碎后用3%NaOH碱化后,晾干,用氯仿浸泡,回收氯仿提取液得浸膏。加酸溶解后,用氯仿萃取,碱化水层,再用氯仿萃取,得到钩吻总生物碱。然后经硅胶柱层析、反相ODS柱层析以及制备型HPLC层析分离纯化,并经理化性质和光谱学数据的测定鉴定单体化合物的结构。结果：共分离得到12个单体化合物,经测定紫外光谱、1H-NMR数据并与文献报道相比较,初步确定两个化合物的结构分别为gelsemine和koumine。结论：通过硅胶柱层析、ODS柱层析和HPLC相结合的方法可以达到分离钩吻总生物碱的目的。     

粤东产钩吻生物碱提取物的红外光谱与核磁共振谱分析

目的 研究粤东产钩吻生物总碱提取物的结构。方法 采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、核磁共振氢谱(¹H NMR)与碳谱(¹³C NMR)、无畸变极化转移增益(distortionless enhancement by polarization transfer,DEPT)波谱分析及元素分析阐明该提取物的化学结构。结果 在4000.0~400.0cm^-1区域内FTIR谱图显示各基团的特征吸收峰;样品的¹H NMR与¹³C NMR指纹图均有高度的特征性和重现性;元素含量与理论值接近。结论 提取物的结构分析与已知化合物钩吻素子结构相符。对粤东产钩吻总生物碱的结构鉴定将为将钩吻开发为安全有效的单体临床制剂、建立中药指纹图谱打下基础。     

钩吻素子对免疫磁珠分离纯化的小鼠CD4+T细胞体外增殖的影响

目的 探讨小鼠脾脏CD4⁺T细胞的分离方法,观察钩吻素子(Kou)对小鼠脾脏CD4⁺T细胞体外增殖的影响.方法 以免疫磁珠分选法从小鼠脾脏细胞中分离CD4⁺T细胞,流式细胞术检测所得细胞的纯度,台盼蓝法检测细胞活力.将10～20μg/ml Kou分别作用于经刀豆蛋白A或植物血凝素刺激的小鼠T淋巴细胞,四唑盐比色法检测细胞增殖情况,用酶联免疫法检测细胞上清中IL-2的含量.结果 经过流式细胞仪测定分离后的小鼠脾脏CD4⁺T细胞纯度达到90.%±5.8%:0.2%台盼兰染色细胞活力为94.9%±.6%;增殖试验表明分离后未加Kou的CD4⁺T细胞对刀豆蛋白A、植物血凝素的刺激保持了良好的增殖能力,当浓度范围为20～20μg/ml时,Kou均能抑制淋巴细胞的增殖(P<0.05),且表现出一定的剂量相关性;不同浓度的Kou(20、100、200μgm1)作用后,CD4⁺T细胞培养上清中的IL-2水平明显低于对照组(P<0.05).结论 免疫磁珠阴性分选法操作简单、快速,可获得较高纯化率、有活性的CD4⁺T细胞;Kou明显抑制小鼠CD4⁺T淋巴细胞增殖反应,此抑制作用可能与Kou抑制小鼠CD4⁺T细胞IL-2的分泌及免疫抑制作用相关.     

钩吻素子对兔血小板聚集的影响

钩吻素子在体外实验中，对由花生四烯酸（ＡＡ）、凝血酶（Ｔｈｒ）、Ｃａ２＋诱导的兔血小板聚集抑制作用的ＩＣ５０分别为０．４５ｇ／Ｌ、０．２２ｇ／Ｌ、０．００１５ｇ／Ｌ，并在一定浓度范围内呈剂量依赖关系。钩吻素子在静注后不同时间内，其抑制血小板聚集作用呈现良好曲线变化，以ＡＡ、Ｔｈｒ为诱导剂，其最大抑制作用的时间分别为静注后５６ｍｉｎ、７８ｍｉｎ处     

钩吻素子体外诱导人结肠腺癌LoVo细胞凋亡的实验研究

目的探讨钩吻素子(Kou)体外能否诱导LoVo细胞凋亡。方法以Kou(50 μmol/L)作用于LoVo细胞,经光镜、电镜和荧光显微镜观察细胞凋亡情况,并用流式细胞仪检测细胞增殖周期状态。结果通过光镜、电镜和荧光显微镜观察均证实Kou可诱导LoVo细胞凋亡,且凋亡百分率随Kou作用时间的延长而升高。经Kou作用后的肿瘤细胞,细胞周期状态发生明显变化,G0/G1期细胞从31.3%上升到42.3%,S期细胞从62.0%下降到38.7%。结论Kou可诱导LoVo细胞凋亡,且存在时间依赖关系,Kou可抑制细胞DNA的合成,阻止细胞由G1期向S期转化。     

钩吻素子治疗银屑病样动物模型的疗效观察

目的 观察钩吻素子(Kou)对银屑病动物模型的疗效.方法 采用鼠尾鳞片表皮和鼠阴道上皮实验模型,不同组别的小鼠给以甲氨蝶呤或不同浓度的Kou,分别观察其对上皮细胞分裂和表皮细胞分化的影响,以及对血清IL-2含量的影响.结果 Kou中、高剂量组能显著抑制阴道上皮细胞有丝分裂、促进鼠尾鳞片表皮颗粒层的生成;Kou低、中、高剂量组均可明显降低小鼠血清IL-2的水平.结论 提示Kou可能通过抑制小鼠表皮细胞增殖与促进其分化并减少炎性因子的生成而发挥作用,为其用于银屑病的治疗提供了实验依据.     

钩吻素子对大鼠焦虑行为的影响

目的进一步明确钩吻素子是否具有抗焦虑作用。方法以大鼠高架十字迷宫实验为动物模型,评价钩吻素子单次皮下注射给药和连续皮下注射给药的抗焦虑活性及特点。结果钩吻素子能显著增加大鼠进入高架十字迷宫开臂次数和在开臂的停留时间百分率(P<0.05,P<0.01);钩吻素子在实验剂量下对大鼠自主运动活性无影响(P>0.05)。结论钩吻素子可能具有抗焦虑作用。     

Oxidative metabolism of koumine is mainly catalyzed by microsomal CYP3A4/3A5

1.?Gelsemium elegans Benth (Loganiaceae) is a toxic plant that can be used for committing suicide besides alleviating pains. Its anti-inflammatory and analgesic effect mainly come from its active ingredient, namely koumine. Koumine, an indole alkaloid, possesses widely pharmacological effects especially inhibition of neuropathic pain.

2.?This study aimed to investigate the metabolic profile of koumine using human liver microsomes (HLMs), selective chemical inhibitors and recombinant human CYP isoforms. Ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) was used to detect and identify metabolites.

3.?Four major metabolites of koumine were found after incubation with HLMs or individual CYP isoforms. The metabolic pathways of koumine included demethylation, dehydrogenation, oxidation and demethyl-dehydrogenation. Chemical inhibition study showed that the inhibitor of CYP3A4/3A5 significantly decreased (93%) the formation of koumine metabolites. Further, CYP3A4/3A5 was shown as the most efficient isoform in biotransformation of koumine, among a series of CYP isoforms tested.

4.?In conclusion, koumine was metabolized into four oxidative metabolites in HLMs. And CYP3A4/3A5 was probably the main contributor to the hepatic oxidative metabolism of koumine.     

钩吻素子诱导人结肠腺癌细胞凋亡的细胞生物学机制研究

目的 探讨钩吻素子体外诱导人结肠腺癌LoVo细胞凋亡的细胞生物学机制.方法 利用激光共聚焦显微技术研究钩吻素子对LoVo细胞跨膜电位、线粒体跨膜电位、细胞内游离钙浓度、活性氧、细胞间通讯的影响.结果 钩吻素子可降低LoVo细胞跨膜电位、线粒体跨膜电位,能降低细胞内游离钙浓度、加入EDTA可使游离钙升高,能增高LoVo细胞的活性氧及细胞间通讯.结论 钩吻素子体外诱导LoVo细胞凋亡的细胞生物学机制可能与上述实验结果有关.     

ROS/JNK/FoxO3a信号通路在钩吻素子抑制结肠癌细胞增殖和诱导凋亡中的作用

目的 以人结肠癌细胞HCT-116细胞为研究对象,通过在培养液中加入不同浓度的钩吻素子（Kou,0,100,200,400 μmol·L^-1）,进一步探讨Kou对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能的分子作用机制。方法 Kou体外干预HCT-116细胞24 h后,用细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测其对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡及活性氧（ROS）的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测叉头蛋白O3a（FoxO3a）mRNA表达情况,采用小干扰核糖核酸（siRNA）进行细胞转染,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测FoxO3a靶基因蛋白的表达情况。结果 与空白组比较,Kou处理明显降低了HCT-116细胞的增殖率（P<0.05,P<0.01）,呈剂量依赖性。与空白组比较,Kou处理引起细胞周期阻滞于G₀/G₁期并诱导HCT-116细胞的凋亡（P<0.05,P<0.01）,其作用与Kou的浓度呈正相关;FoxO3a siRNA干扰显著降低了FoxO3a及其下游相关细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21）,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（p27）和细胞死亡调解子（Bim）蛋白的表达（P<0.01）。与空白组比较,Kou处理诱导了HCT116细胞中氨基末端激酶（JNK）的活化（P<0.01）,JNK特异性抑制剂（SP600125）处理抑制了Kou诱导的FoxO3a活化及其下游相关蛋白的表达（P<0.01）;乙酰半胱氨酸（NAC）处理显著降低了Kou诱导的ROS水平和JNK信号的活化（P<0.01）。结论 Kou能有效抑制结肠癌细胞HCT-116的增殖,促进HCT-116细胞的凋亡,其机制可能与其作用于ROS/JNK/FoxO3a途径有关。