乙型肝炎病毒基因组转染HepG2细胞的microRNA表达研究

目的 检测乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转染对人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞中microRNA(miRNA)表达的影响,为进一步探讨肝细胞中HBV复制的分子生物学机制提供平台.方法 分别提取HepG2.2.15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞,实验组)和其亲本HepG2细胞(对照组)的总RNA并分离miRNA,采用含509条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析.用SAM软件针对差异miRNA筛选的标准为在两组之间荧光强度差异4倍以上,差异miRNA的整体假阳性率为0.选择其中2个miRNA,应用实时荧光定量RT-PCR方法对芯片结果进行验证.结果 HepG2.2.15细胞与HepG2细胞间差异表达的miRNA共27个(占5.3%),其中7个表达上调,20个表达下调.miR-181d和miR-15a的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片表达结果基本一致.结论 肝细胞中存在着与HBV复制相关的miRNA,这些上调和下调表达的miRNAs可能参与了HBV在肝细胞中的复制.     

聚合酶链反应检测尖锐湿疣皮损内人乳头瘤病毒

１３个皮损组织取自１３例尖锐湿疣（ＣＡ）患者，１３例基底细胞上皮瘤（ＢＣＣ）组织作为对照，用溴化钠液分离表真皮，从组织中提出的 ＤＮＡ和溴化钠液分别用聚合酶链反应检测 ＨＰＶ ＤＮＡ。１１例ＣＡ表皮中检出 ＨＰＶ ＤＮＡ，ＨＰＶ６有７例，ＨＰＶ１１有４例。３例ＣＡ真皮中发现有ＨＰＶ ＤＮＡ，ＨＰＶ６有２例，ＨＰＶ１１有１例。２例标本因溴化钠液被ＨＰＶ污染未作统计。在ＢＣＣ组织中未发现有ＨＰＶ ＤＮＡ。在某些ＣＡ真皮内含有 ＨＰＶ ＤＮＡ可以解释散发病例的复发性。     

长链核酸扩增技术评价病毒灭活效果的研究

目的:探讨用长链核酸扩增技术评价病毒灭活效果的可行性.方法:针对伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)糖蛋白gD基因前后的保守区设计预计产物长短不一的5对引物,用半巢式PCR技术扩增经低pH法(4.0±0.1)、巴氏消毒法[(60±1.0)℃]和s/D法(有机溶剂/洗涤荆)处理后的PRV核酸,同时以细胞感染法做平行对照.结果:低pH对PRV核酸有破坏作用,处理时间越长,核酸损伤程度越明显,处理60 min时,6.62 lgTCID50的PRV完全被灭活.5条不同长度PCR扩增产物中,只有3.9 kb的长片段检出与细胞培养结果一致.7.25 lgTCID50的PRV经(60±1.0)℃处理20 min后即被完全灭活,7.13 lgTCID50的PRV经s/D法处理1 h后被完全灭活,但各长度核酸片段扩增均为阳性,与细胞感染试验结果不符.结论:低pH对PRV核酸的损伤程度随处理时间的延长而增加;用长链PCR(3.9 kb)技术来评价经低pH法灭活病毒的效果是可行的,而该法不适合评价巴氏消毒法和S/D法灭活病毒的效果.     

丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白1基因的克隆化与序列分析

目的 对命名为F蛋白结合蛋白1(FBP1)的未知基因,克隆其全长基因并进行生物信息学分析.方法 应用酵母双杂交技术得到FBP1,应用分子生物学技术克隆FBP1的基因编码序列.结果 经酶切和测序鉴定,结果完全正确,成功克隆了FBP1的基因编码序.结论 FBP1通过与F蛋白结合,在病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用过程中发挥重要作用.     

东部马脑炎病毒E2基因与GM-CSF共表达质粒的构建及其免疫原性初步研究

目的:利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为基因佐剂,提高东部马脑炎病毒E2基因重组质粒的免疫效果.方法:分别扩增E2基因与GM-CSF基因,连接进入含有内部核糖体插入位点(IRES)的真核表达载体中,构建共表达质粒.Lipofectamine2000介导转染真核细胞BHK-21,反转录PCR检测E2和GM-CSF两个基因的转录,Western印迹法和间接免疫荧光法(IFA)检测细胞内E2基因表达产物的抗原性.通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,IFA法测定血清抗体效价,FACS测定免疫小鼠脾细胞中CD4 /CD8 淋巴细胞构成比,初步观察共表达质粒的免疫原性.结果:经酶切鉴定与序列测定证明重组共表达质粒中含有E2和GM-CSF两个基因且序列正确.转染细胞的反转录PCR可见E2和GM-CSF两个基因的转录.Western印迹结果可见转染细胞的裂解液在相对分子质量50 000位置有特异性条带.将转染细胞制成荧光抗原片,经IFA检测可见胞浆中出现特异荧光.免疫小鼠的最高血清抗体效价为1:160,但细胞免疫未观察到明显的提高.结论:构建的共表达质粒pE2-IRES-mGM-CSF具有良好的免疫原性,能有效刺激小鼠特异性体液免疫应答,提高了E2基因重组质粒诱导的血清抗体效价.     

汉滩病毒G1蛋白胞质区ITAM样基序与Syk细胞内相互作用

目的：研究汉滩病毒（HTNV）G1蛋白胞质区ITAM样基序与Syk的细胞内相互作用。方法：构建用于研究Syk和G1ITAM样基序之间相互作用的哺乳动物细胞双杂交系统，验证G1ITAM样基序与Syk之间是否存在细胞内相互作用。结果：哺乳动物细胞双杂交分析证实G1ITAM样基序在哺乳动物细胞内可以与Syk相互作用；而突变体分析表明，这种相互作用依赖于该基序中两个高度保守的酪氨酸残基的存在。结论：HTNVG1蛋白胞质区高度保守ITAM样基序在体外和哺乳动物细胞内可以与Syk相互作用，为进一步探讨G1蛋白ITAM样基序在HFRS免疫信号传递中的作用及其与血管内皮损伤的关系奠定了基础。     

Epstein-Barr病毒壳抗原gp125的纯化和应用

目的研制ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ（ＥＢ）病毒诊断试剂。方法将重组痘苗病毒表达的Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ病毒（ＥＢＶ）壳抗原（ＶＣＡ）主要多肽ｇｐ１２５纯化，作为诊断抗原建立了酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），检测了４８份鼻咽癌（ＮＰＣ）病人血清及１０份正常人血清中的ＶＣＡ／ＩｇＡ抗体。结果该方法与免疫荧光（ＩＦ）检测结果一致，但ＥＬＩＳＡ的平均几何滴度（ＧＭＴ）是ＩＦ的１２倍。结论以纯化的ＥＢ病毒壳抗原主要多肽ｇｐ１２５作为诊断抗原建立的检测方法，更适合于ＥＢＶ相关疾病的血清学诊断和血清流行病学调查。     

重组猪戊型肝炎病毒ORF2区主要抗原域的原核表达及鉴定

目的：在大肠杆菌中表达猪戊型肝炎病毒ORF2区主要结构蛋白,并对其进行血清学鉴定。方法：通过RT-PCR技术从一份猪粪中扩增并克隆戊型肝炎病毒主要的结构基因片段,将该片段插入pET-32a表达载体,在原核系统中融合表达蛋白,Western blot和间接ELISA方法分析该蛋白的抗原性。结果：SDS-PAGE分析结果表明,获得45kD的目的蛋白,该重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,而不与阴性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。结论：本研究获得了猪戊型肝炎病毒重组抗原,可与HEV阳性血清产生特异性的结合反应,可以作为诊断用的重组蛋白,为研制敏感、特异的HEV诊断试剂盒,行之有效的HEV基因工程疫苗及为HEV感染的预防和临床治疗提供资料。