粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对结肠癌肝转移的促进作用及其可能机制

目的：探讨粒细胞-巨噬细胞集落因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）对结肠癌肝转移的促进作用及其可能机制。方法：采用稳定转染方法将GM-CSF 基因以及靶向GM-CSF 的shRNA 分别导入人结肠癌细胞系HCT116 和SW480,用ELISA法检测GM-CSF表达水平。脾内注射结肠癌细胞建立结肠癌肝转移模型,部分模型小鼠隔天腹腔注射不同剂量（3、0.6 μg）的重组人GM-CSF。模型建立后4 周后观察肝大体及肿瘤转移灶,实时荧光定量PCR检测神经钙黏素（Ncadherin）和基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP2）的表达,Western blotting 检测上皮钙黏素（E-cadherin）的表达。结果：根据GM-CSF表达量建立GM-CSF低、中、高表达细胞系（GMlo、GMint、GMhiHCT116）和GMKDSW480 细胞系。大体和病理结果均显示,接种高表达GM-CSF的HCT116 细胞或外源性给予GM-CSF明显增加小鼠结肠癌肝转移灶数量,而敲低GM-CSF的作用则相反。GM-CSF能够显著上调N-cadherin 和MMP2 的表达,同时下调E-cadherin 的表达（P<0.05）。结论：GM-CSF能够促进结肠癌移植瘤的肝转移,该效应可能与E-cadherin表达的下调和N-cadherin以及MMP2表达的上调有关。     

重症肌无力小鼠模型的建立

1961年,在美国召开了一个比较病理学研讨会。40余年后的今天,比较病理学的“比较”理念已扩展到整个医学领域,把一切以比较方法研究包括人类这一物种在内的动物界之正常与异常生命现象及其诊治问题的结果,冠以“比较医学”这一学科名称。以此为名的中国学术期刊、专著与论文也随之出现了。在上述的那次研讨会上,包括人医与兽医等在内的各方与会学者还讨论了如何加     

雌激素对实验性自身免疫性脑脊髓炎的保护作用

目的 检测雌激素在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的预防性治疗作用并初步探讨其体内作用机制.方法 用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)和完全弗氏佐剂(CFA)免疫C57BL/6J小鼠制备EAE模型;雌激素于建模始每日皮下注射50 μmol/L进行治疗,通过发病指数评分、脊髓病理分析、炎症因子水平检测,并应用流式细胞仪(FACS)及实时荧光定量PCR(qPCR)评价治疗效果;进一步通过分析小鼠脾细胞及脊髓相关功能分子CD4/PD-l、CD19/PD-L1、CD4/CD25/Foxp3、CD19/CD21/CD23及CD 19/CD5/CDl dhigh的表达变化,探讨雌激素可能的作用机制.结果 雌激素预防性治疗可有效延缓EAE小鼠的发病,减轻脱髓鞘病变.病理结果显示,雌激素治疗能减少小鼠脊髓组织炎性细胞的浸润,同时下调外周炎性因子TNF-a及IL-17A的分泌表达(P＜0.01);与模型组相比,雌激素治疗下调T淋巴细胞表面活化分子CD69的表达(P＞0.05)并可显著上调CD4+T细胞表面PD-1的表达(P＜0.05);同时,雌激素治疗后PD-1的配体CD19+B细胞表面PD-L1的表达明显上调(P＜0.01),脾细胞中CD19+CD21highCD23low(P＜0.01)及CD19+CD5+CD1dhigh(P＜0.01)的比例也有不同程度的升高,但对脾细胞中CD4+CD25Toxp3*的表达无明显作用.结论 雌激素预防性治疗可延缓EAE小鼠的发病进程,其作用机制可能与上调PD-1/PD-L1通路并上调调节性B细胞水平有关.     

VEGF在溃疡性结肠炎癌变中的作用及其可能的机制

目的： 观察血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor, VEGF）信号对溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）癌变的影响并探讨其作用机制。 方法： 建立小鼠肠炎相关结直肠癌（colitis-associated colorectal cancer,CAC）模型,用流式细胞术和real-time PCR分别检测模型小鼠外周血、脾脏、骨髓及瘤组织中髓样来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cell,MDSC）的比例和MDSC中精氨酸酶1（arginase-1, Arg-1）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）mRNA的表达,ELISA法检测结肠和CAC组织培养上清中VEGF的表达。以索拉菲尼（sorafenib）或VEGF单抗阻断VEGF信号后,检测小鼠结肠和CAC部位MDSC比例的变化和病理改变。 结果： 成功建立小鼠CAC的模型,并根据多项评价指标确定建模后1个月和3个月为CAC的早期和晚期。在CAC形成过程中,小鼠体内Gr-1+CD11b+MDSC细胞数量明显增多,病灶部位MDSC的积聚尤甚,对照组为（0.30±0.18）%、CAC早期组为（1.32±0.04）%、CAC晚期组为（3.08±0.29）%（P<0.05）。这些MDSC细胞高表达 Arg-1和iNOS （P<0.05),但病灶部位L-精氨酸含量显著降低\[早期组为（4.22±0.17）μg/ml、晚期组为（2.95±1.08）μg/ml、对照组为（4.41±0.16）μg/ml,P<0.05\]。此外,与对照组相比,CAC早期和晚期病灶组织高表达VEGF \[CAC早期组为（1 170±94.43）pg/ml、晚期组为（1 117±71.92） pg/ml、对照组为（877.6±31.67）pg/ml,P<0.05\]。索拉菲尼或VEGF抗体的治疗可显著抑制病灶部位MDSC的积聚。 结论： VEGF信号在CAC形成过程中发挥重要的促瘤功能,其作用机制可能与诱导MDSC在病灶部位的聚集有关。     

T细胞耐受的信号转导研究进展

免疫耐受是指机体免疫系统在接触特定抗原后, 产生的对该抗原的特异性无反应状态, 或称为负免疫应答。免疫耐受主要包括T细胞耐受和B细胞耐受。对T细胞耐受的研究比B细胞耐受的研究有较大的临床应用意义。有关T细胞耐受的信号通路研究, 近两年逐渐呈现为研究热点。以下将对进几年有关T细胞耐受所涉及到的信号通路研究作一综述。1　TCR信号复合体TCR识别抗原表位所产生的第一信号在T细胞耐受与T细胞激活中起重要的作用。有关CD3信号通路所介导的T细胞免疫耐受的研究较多, Szegezd等 [1]对正常小鼠, 应用anti CD3上调胸腺细胞表达…     

调节性B细胞的研究进展

B细胞除了能通过产生抗体,提呈抗原来发挥免疫作用外,还有免疫抑制功能。机体内存在少量的调节性B细胞(Breg),能通过分泌抑制性细胞因子(如IL-10、肿瘤坏死因子等)或直接的细胞接触诱导免疫耐受、抑制过度炎症反应等,从而发挥免疫调节功能。B细胞在自身免疫性疾病、肿瘤免疫、抗感染免疫、移植耐受的维持等方面都发挥着重要作用。本文主要对Breg细胞的功能相关分子、作用机制以及与疾病的相关性等方面进行综述。     

实验性败血症小鼠模型的建立及评价

白血病、恶性淋巴瘤、再生障碍性贫血等造血系统恶性疾病，在应用化疗或大量的免疫抑制剂之后常常合并严重感染，使得近年来败血症的发生逐年增多，败血症早期诊断困难，死亡率高。本研究建立成熟的实验性败血症小鼠模型，为探讨败血症中的致病机制提供体实验基础。以经典的盲肠结扎穿孔（CLP）方法建立实验性败血症小鼠模型，用ELISA法检测补体C5a、IL-6、TNF—α、IFN-γ的水平，流式细胞术检测胸腺和肠系膜淋巴细胞的凋亡，HE染色方法观察胸腺和脾的病理损伤。实验结果显示，70％-80％左右的动物于术后72小时内死亡，在限定的观察时间内只有20％左右动物生存，CLP手术组的动物体重也有明显降低，补体C5a、IL-6、TNF—α、IFN-γ等与败血症相关的炎症介质在CLP手术后均表现为显著的上调，CLP术后20小时小鼠胸腺及肠系膜的CD4^＋淋巴细胞均出现了明显凋亡，胸腺及脾组织也发生了明显的病理损伤，研究结果显示了动物模型的可靠性和可行性。结论：本研究成功建立了败血症小鼠模型（CLP），为进一步探讨恶性血液病并发败血症的发病机制及干预策略提供了必要条件。     

用于IDDM基因治疗的rAAV2-GAD-Ig的研制

目的: 构建重组真核表达载体pSNAV- GAD -Ig[GAD- Ig融合基因是由小鼠GAD(glutamicaciddecarboxylase)基因插入到小鼠IgG3重链(Ig)基因的N端而成的 ], 制备含GAD- Ig融合基因cDNA的重组缺陷型腺相关病毒 -2 (rAAV2- GAD -Ig), 并探讨rAAV2所介导的GAD- Ig是否能诱导I型糖尿病(IDDM)动物模型 NOD(nonobesediabetic)小鼠产生特异性免疫耐受。方法: 从含GAD- Ig融合基因的中介载体BSSK(BSSK- GAD- Ig)中, 用PCR方法扩增目的基因片段, 并克隆入真核表达载体pSNAV中, 构建重组真核表达载体pSNAV- GAD Ig。以脂质体法将pSNAV GAD -Ig转染到rAAV2包装细胞BHK -21中, 产生rAAV2 -GAD- Ig。采用R-T PCR、Westernblot和ELISA法, 检测rAAV2- GAD -Ig感染的BHK- 21细胞中目的基因的表达。应用GAD抗原体外诱导特异性T细胞的二次应答, 来检测rAAV2所介导的GAD -Ig是否能诱导NOD小鼠产生特异性免疫耐受。结果: GAD- Ig目的基因已整合到靶细胞的基因组中, 并能以分泌形式表达目的蛋白GAD- Ig。将rAAV2 GAD- Ig肌注后, NOD小鼠能产生特异性免疫耐受。结论: 获得了可用于NOD小鼠治疗研究的rAAV2 GAD- Ig。     

Tim-3抗体的生物学活性及应用研究

目的：制备抗人Tim-3单抗并评价其生物学活性,为干预Tim-3表达失调引发的疾病提供实验基础。方法制备重组人Tim-3蛋白,常规方法免疫BALB/c小鼠,筛选出阳性克隆,并对其识别、中和活性进行体内外验证,探讨其作为免疫干预手段的可行性。结果①获得一株能够分泌具有较好结合活性的抗人Tim-3单克隆抗体细胞株（克隆号L3D）,其分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a;②流式实验结果表明,该抗体能够结合人U937细胞上的Tim-3分子,且与小鼠RAW 264．7细胞上Tim-3有一定的交叉结合活性;③该抗体能够阻断Gal-9分子诱导的人THP1细胞凋亡,具有良好的体外中和活性;④体内注射L3D,显示该抗体能够显著加重脓毒血症模型小鼠病情,提高炎性因子的表达水平,显示出其良好的体内中和活性。结论成功制备一株分泌抗人Tim-3抗体的细胞株,其良好的结合及中和活性为基于Tim-3表达异常相关疾病的干预提供了实验基础。     

雌二醇体外诱导对调节性B细胞分泌IL-10的影响

目的：探讨雌二醇体外诱导小鼠脾B淋巴细胞分泌表达白细胞介素（IL）-10的作用。方法利用磁珠分选技术分选纯化小鼠B细胞,雌二醇体外作用3 d后,收集细胞,分别利用ELISA、Q-PCR、流式细胞仪及Western印迹法检测细胞培养上清中IL-10的水平,细胞内IL-10、PD-L1及RBM47 mRNA的表达,以及细胞内IL-10、细胞膜表面PD-L1和细胞内RBM47的蛋白表达水平。结果雌二醇能够诱导B细胞分泌表达IL-10;上调IL-10+调节性B细胞（Breg细胞）比例,同时能够上调B淋巴细胞表面PD-L1的表达。另外,雌二醇作用能够上调B淋巴细胞RBM47的转录及蛋白表达水平。结论雌二醇体外诱导能够上调产生IL-10的Breg细胞,雌二醇的这种作用可能与上调RBM47分子有关。