神经酰胺诱导肝癌细胞凋亡

目的:观察C2-神经酰胺诱导肝癌细胞凋亡,为进一步研究肝癌细胞凋亡信号的传导提供实验依据.方法:将C2-神经酰胺作用于肝癌细胞SMMC-7721及BEL-7402后,分别行H-E染色、荧光染色、TUNEL方法检测及流式细胞仪Sub-G1法,检查细胞的凋亡.结果:10 μmol/L C2-神经酰胺作用肝癌SMMC-7721细胞,48 h后发生凋亡,H-E染色及荧光染色检测可见典型的细胞凋亡表现,细胞核固缩、碎裂,以及碎裂的细胞核浓染成为凋亡小体.经流式细胞仪检测可见典型的Sub-G1凋亡峰,凋亡细胞占细胞总数(9.20±0.73)％.在BEL-7402细胞也观察到相似的结果.结论:C2-神经酰胺可诱导肝癌SMMC-7721及BEL-7402细胞的凋亡.     

腺病毒载本的细菌内同源重组系统的建立和初步应用

肿瘤的基因治疗是近年的研究热点。理想的基因治疗应具有目的基因高效性、靶向性转 移和可控性表达的特点。目前的关键问题是新型载体的构建。复制缺陷性腺病毒具有感染细 胞范围广、滴度高,而且可在细胞周期的任何时段感染的优点,因此被越来越多地应用于基 因治疗的研究中。哺乳动物包装细胞293或911内的同源重组是产生重组腺病毒的传统方法, 但繁琐、低效,限制了腺病毒载体的更广泛应用。现在已经有一种新的载体系统［1］ ,利用了细菌中高效的同源重组机制代替哺乳动物细胞,同时利用在同源重组时整合入腺 病毒骨架中的绿色荧光蛋白（GFP）可以直接观察转染与感染的效率,大大方便了腺病毒的 重组与纯化。我们应用该细菌同源重组系统构建了携带GFP的重组腺病毒载体,并在感染后 的Hepa1-6细胞中观察到了GFP的表达,为该系统在基因治疗中的进一步应用提供了实验依 据。     

腺病毒介导的双荧光素酶报告系统的构建及其应用

目的： 构建腺病毒介导的双荧光素酶报告系统,并利用其筛选一种广谱高活性启动子。方法：将待检测启动子控制的萤火虫荧光素酶（Fluc）基因表达框插入腺病毒E1区,CMV启动子控制的海肾荧光素酶（Rluc）基因表达框插入E3区作为内参,构建腺病毒介导的双荧光素酶报告系统。检测不同病毒感染量条件下测得的启动子活性数据差异、组内差异,难转染细胞内的转染情况,分析该系统的操作简便性、稳定可靠性。应用该系统检测常用启动子CAG、CASI及新启动子CCAU在一系列细胞内的活性,从中筛选出一种广谱高活性启动子。结果： 成功构建了腺病毒介导的双荧光素酶报告系统;不同MOI值下测得的各启动子相对活性值无显著差异（P>0.05）;在所实验的细胞内均能有效且准确地测定各启动子的活性,且复孔间方差小;CCAU在所实验的9株细胞中的表达活性显著（P<0.05）或极显著地（P<0.01）高于CASI以及CAG的表达活性。结论： 构建获得的腺病毒介导双荧光素酶报告系统操作简便、稳定可靠、通用性强,可作为启动子活性筛选的一种新方法;利用该系统筛选获得了一种新的广谱高活性启动子CCAU。     

腺病毒CNHK200-hEndostatin质量控制方法的研究

目的:建立基因-病毒治疗系统CNHK200-hEndostatin的质量控制方法.方法:分别建立腺病毒蛋白鉴定、腺病毒基因组鉴定、人内皮抑素(hEndostatin)基因鉴定、人内皮抑素表达量检测、腺病毒颗粒数测定、腺病毒滴度和比滴度测定、纯度测定、野生型腺病毒(AdWT)检测、残余宿主DNA含量检测和牛血清蛋白残余量检测等腺病毒质量控制项目的方法,并对纯化的腺病毒样品进行初步检测.结果:建立用SDS-PAGE方法对腺病毒进行蛋白鉴定,用限制性内切酶图谱分析的方法对腺病毒进行基因组鉴定,用PCR方法鉴定人内皮抑素基因,用ELISA方法检测人内皮抑素表达量,用D260法和HPLC方法进行腺病毒颗粒数测定,用D260/D280方法和HPLC方法进行纯度检测,用PCR方法进行野生型腺病毒检测,用杂交方法进行残余宿主DNA含量检测,用反向间接血凝实验测定牛血清蛋白残余量.结果表明建立的方法可有效应用于腺病毒样品检测,并且我们制备的纯化腺病毒样品均符合要求.结论:基本建立了腺病毒CNHK200-hEndostatin的质量控制方法,改良的应用HPLC对腺病毒颗粒数进行定量检测的方法准确迅速,优于传统方法.应用建立的方法对纯化的腺病毒样品进行检测,基本符合临床应用要求.     

细胞融合肝癌疫苗体内抗肿瘤特异性及T细胞作用的初探

目的：观察大鼠ＢＥＲＨ－２肝癌细胞与自体激活Ｂ细胞的融合细胞作为疫苗抗肿瘤作用的特异性，并观察该肝癌疫苗体内抗肿瘤作用与Ｔ细胞亚群的关系。方法：（１）应用聚乙二醇（ＰＥＧ）融合大鼠ＢＥＲＨ－２肝癌细胞与激活Ｂ细胞制备细胞融合大鼠肝癌疫苗；（２）事先经该肝癌疫苗免疫的大鼠分别接种肝癌ＢＥＲＨ－２细胞和大鼠膀胱癌ＮＢＴ－Ⅱ细胞，观察该肝癌疫苗抗肿瘤作用的特异性；（３）该肝癌疫苗免疫大鼠之前或之后，以小鼠抗大鼠ＣＤ４单抗或抗ＣＤ８单抗多次注射，以清除大鼠ＣＤ４＋或ＣＤ８＋Ｔ细胞，随后观察大鼠的成瘤性。结果：ＢＥＲＨ－２细胞不能在经细胞融合大鼠肝癌疫苗免疫的大鼠体内致瘤，而ＮＢＴ－Ⅱ细胞可致瘤；事先清除ＣＤ４＋或ＣＤ８＋Ｔ细胞的大鼠经细胞融合大鼠肝癌疫苗免疫后仍能被肝癌ＢＥＲＨ－２细胞致瘤；而经该肝癌疫苗免疫的大鼠，清除了ＣＤ４＋细胞后不能被ＢＥＲＨ－２细胞致瘤，清除了ＣＤ８＋细胞后则可被ＢＥＲＨ－２细胞致瘤。结论：细胞融合大鼠肝癌疫苗有特异性抗肿瘤作用，这种作用与ＣＤ４＋和ＣＤ８＋Ｔ细胞有关     

高效毛细管电泳法测定甘草酸注射液中甘草酸含量

目的建立一种测定甘草酸注射液中甘草酸含量的高效毛细管电泳法.方法10mmol.L-1磷酸缓冲液(pH7.0)中含12.5mmol.L-1十二烷基硫酸钠(SDS)为电泳电解质,电压30kV,检测波长254nm,毛细管有效长度50cm,管径50μm.氨茶碱为内标.结果甘草酸与氨茶碱的迁移时间分别为4.8和2.8min.甘草酸浓度为62.5～1000mg.L-1时,其浓度与峰面积呈良好线性关系,相关系数(r)为0.9997.日内、日间变异系数均小于5.0%.结论该方法简单、快速、灵敏,重现性良好,具有较强实用价值.     

细胞融合大鼠肝癌疫苗体内治疗和预防作用研究

目的 :观察大鼠 BERH - 2肝癌细胞与激活 B细胞的细胞融合大鼠肝癌疫苗对肿瘤的预防和治疗作用。方法 :应用 PEG将大鼠 BERH- 2肝癌细胞与激活 B细胞融合 ,制备细胞融合大鼠肝癌疫苗 ;部分肝癌疫苗免疫动物前经 6 0 Co照射 ;大鼠被肝癌疫苗免疫之前或之后 ,接种肝癌 BERH- 2细胞或组织块 ,观察疫苗对肝癌的预防和治疗作用。结果 :经细胞融合疫苗保护的大鼠可获 10 0 %无瘤生存 (8/8) ,而 HERH- 2或照射后 BERH- 2对照组大鼠均生长肿瘤死亡 (0 /8)。经皮下接种细胞融合肝癌疫苗治疗大鼠 ,肝内注射肝癌细胞的大鼠可获 85 %以上无瘤存活。照射后细胞融合肝癌疫苗与未照射的获得同样治疗效果。不经筛选的细胞融合疫苗也获相同治疗效果 ,而对照组大鼠均生长肿瘤后死亡。结论 :细胞融合肝癌疫苗对大鼠有预防和治疗作用 ,照射的细胞融合大鼠肝癌疫苗和不经筛选的融合细胞同样具有较好的治疗作用。     

肿瘤特异增殖腺病毒CNHK200-hEndo的构建及其抗裸鼠肺癌移植瘤疗效

目的：构建一种携带抗肿瘤血管生成基因Endostatin的新型肿瘤基因-病毒治疗系统CNHK200-hEndo,观察其对人肺癌细胞裸鼠移植瘤的治疗效果。方法：克隆人抗血管生成基因Endostatin,利用病毒重组技术将该基因插入肿瘤特异性增殖腺病毒CNHK200的基因组中,扩增并纯化CNHK200-hEndo病毒。建立裸鼠肺癌细胞移植瘤模型,观察CNHK200-hEndo抗肿瘤的效果,并与非增殖病毒Ad-hEndo对照。结果：成功构建一种新型的基因-病毒治疗系统CNHK200-hEndo,其E1b55kDa蛋白表达缺失。CNHK200-hEndo能在肿瘤细胞内大量增殖并高效表达Endostatin蛋白,表达量明显高于非增殖病毒Ad-hEndo（P〈0.05）。动物实验证实,CNHK200-hEndo对人类肺癌细胞的裸鼠移植瘤模型具有抑制肿瘤生长的疗效,与Ad-hEndo和空白对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：构建的基因-病毒治疗系统CNHK200-hEndo能在肺癌细胞中增殖复制,提高Endostatin蛋白的表达,明显抑制肺癌细胞移植瘤的生长。     

表达SIRPα-Fc的基因-溶瘤腺病毒对胆管癌治疗作用的实验研究

目的:研究表达SIRPα-Fc融合基因的基因-溶瘤腺病毒SG655-SF对胆管癌的治疗作用。方法:将信号调节蛋白α(signal regulatory proteinα,SIRPα)突变体CV1与人Ig G1 Fc段融合(简称SF),构建SF编码序列(基因)。将SF基因插入条件增殖型腺病毒载体SG655,构建基因-溶瘤腺病毒SG655-SF。重组病毒经鉴定正确后,经扩增、滴度测定,感染293细胞。Western blot检测外源基因的表达情况。间接免疫荧光检测293细胞表达的SF蛋白对胆管癌细胞的结合能力。噻唑蓝(MTT)法测定病毒对胆管癌细胞的杀伤作用。建立人类胆管细胞癌裸鼠移植瘤模型,用SG655-SF治疗,观察疗效。取肿瘤组织进行切片检查,验证其抗肿瘤作用。结果:成功构建SF表达框、基因-溶瘤腺病毒SG655-SF。SG655-SF感染293细胞后,能高效表达SF蛋白。293细胞表达的SF蛋白能有效结合CD47高量表达的胆管癌细胞株EH-CA1-T、EHCA1-Y。SG655-SF能有效杀伤胆管癌细胞。SG655-SF可以有效抑制肿瘤在裸鼠体内生长。肿瘤组织切片检查提示有肿瘤坏死和病毒浸润。结论:基因-溶瘤腺病毒SG655-SF具有良好的抗胆管癌活性。