肝癌组织靶向性正义与反义表达载体pEBAF/N-ras的构建

目的用分子克隆技术构建肝癌组织特异性N-rascDNA正义与反义表达载体.方法用BamHI酶切携带目的基因的质粒pZIP-NeoSV(X)1,获得1.06kbN-rascDNA;同时以BamHI将载体pEBAF线性化,并行去磷酸化修饰,用T4DNA连接酶将两者连接,转化感受态细菌DH5α.先以酶切和随机引物法标记的N-rascDNA探针进行菌落原位杂交筛选阳性重组克隆,再以PvuⅡ酶切鉴定插入方向,同时进行DNA测序和同源性分析.结果成功构建肝癌组织特异性正义与反义表达载体pEBAF/s-N-ras和pEBAF/as-N-ras.结论成功构建的N-rascDNA正/反义表达载体,为原发性肝癌的发生机理和基因治疗研究奠定良好的基础.     

p16在肝细胞癌组织内变异的研究

应用分子杂交及免疫组化方法检测５６例ＨＣＣ组织内的抑癌基因ｐ１６。结果显示,ＨＣＣ标本中ｐ１６蛋白在癌细胞内表达的阳性率为３７５％（２１／５６）,而ｐ１６ＤＮＡ斑点杂交的阳性率为５５３６％（３１／５６）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交证实,１２５％（７／５６）ＨＣＣ标本存在ｐ１６的甲基化变异,４４６４％（２５／５６）ｐ１６基因缺失。提示ＨＣＣ发生、发展过程中存在ｐ１６基因的缺失和甲基化变异     

基因工程学理论和技术教学经验浅谈

基因工程学是一门新兴的前沿科学,已成为二十一世纪生命科学中一门重要的学科,基因工程技术已渗透到医学、工业、农业等多种生命科学领域。现已利用基因工程的技术对二十多种疾病,七百多个病人进行基因治疗;已使许多疾病的发病机理得以阐明,使临床上不少疾病的诊断和治疗有了长足的进步,基因工程药物的生产和临床应用,不仅推动了医学的发展,而且带动了医药工业的腾飞;转基因植物的成功大大提高了农作物的产量并使我们的世界更加灿烂;克隆羊的出现震惊了全世界。二十一世纪,基因工程将发挥更大的作用。     

移植前血清细胞因子水平对重型再生障碍性贫血患者异基因造血干细胞移植疗效的影响研究

目的:探讨重型再生障碍性贫血(SAA)患者异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)前细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α水平对预后的影响。方法:本研究共纳入117例SAA接受allo-HSCT的患者,回顾性分析患者总体生存率(OS)、移植物抗宿主病(GVHD)发生率、细胞因子水平与OS及主要移植并发症的关系。结果:本研究纳入的SAA患者包含同胞HLA全相合allo-HSCT 78例(66.7%),非亲缘供者allo-HSCT 12例(10.2%),单倍体相合供者alloHSCT 27例(23.1%)。所有患者5年OS率为76.0%(95%CI:64.4%-87.5%)。a GVHD累积发生率为49.6%(95%CI:40.4%-58.8%);c GVHD累积发生率为31.6%(95%CI:23.1%-40.2%)。接受同胞HLA全相合allo-HSCT的患者,其5年OS率明显优于替代供者(82.3%±6.6%vs 61.3%±11.7%)(P0.05)。HLA匹配程度、供者年龄、移植后巨细胞病毒/EB病毒(CMV/EBV)血症是影响a GVHD发生的重要因素。移植前血清IL-6增高的患者,移植后血小板植入较快(14.6±1.8 vs 18.3±2.6 d)(P=0.05);血清TNF-α增高的患者,移植后CMV/EBV血症发生率较低(37.8%±11.1%vs 58.8%±16.8%)(P=0.029)。结论:HLA匹配同胞供者allo-HSCT是SAA患者有效治疗手段;供者选择仍然是影响预后的重要因素。移植前血清IL-6和TNF-α水平增高可能预示allo-HSCT后患者血小板植入加快,CM V/EBV血症发生率减低。     

caspase-8靶向小发夹RNA抑制肝细胞凋亡的研究

目的研究针对caspase-8 mRNA的小发夹RNA(shRNA)真核表达载体对肝Hepa1-6细胞凋亡的干扰作用。方法TNF-α诱导Hepa1-6细胞凋亡,脂质体法将shRNA表达载体转染入Hepa1-6细胞中,24h后应用荧光实时定量PCR和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平测定其caspase-8表达差异,流式细胞仪观察细胞凋亡的变化。结果TNF-α作用后Hepa1-6细胞caspase-8 mRNA由(0.050±0.006)升高至(0.286±0.063)(P<0.01),而shRNA表达载体Pgenesil-casp8使其下降至(0.098±0.037)(P<0.01)。转染Pgenesil-casp8重组质粒后caspase-8蛋白表达与mRNA荧光实时定量PCR结果吻合。TNF-α诱导Hepa1-6细胞凋亡率由(4.70±0.89)%升高至(17.40±2.21)%(P<0.01),Pgenesil-casp8作用后下降至(1.20±0.32)%(P<0.05)。结论针对caspase-8 mRNA的shRNA真核表达载体可有效抑制肝细胞Hepa1-6凋亡。     

反义c-myc表达载体的构建及其瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应

目的:构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立新型的c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,研究瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应。方法:XbaI和HindIII双酶切携带目的基因的质粒pcMYC和pcDNA3.1(-)真核表达载体,T4DNA连接酶连接,构建c-myc反义RNA表达载体。合成针对表皮生长因子受体(EGFR)的相应16肽GE7和流感病毒血凝素功能域的HA20寡肽,并与多聚赖氨酸连接,连接物与c-myc的反义RNA表达载体混合,构建新型c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,即四元复合体。结果:成功构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立了as-myc四元复合体基因转移系统,经HepG2.2.15细胞系瞬时转染,证实c-myc蛋白的表达下降。结论:构建的反义表达载体pcDNA3.1-as-myc具有阻断c-myc表达的效应。     

人CD137L在肿瘤细胞的表达及其对肿瘤细胞分泌IL-8的影响

目的 :检测人CD137L在肿瘤细胞的表达及其功能。方法 :采用RT PCR、FACS方法检测人CD137L在肿瘤细胞的表达 ,用ELISA方法检测CD137L对肿瘤细胞分泌IL 8的影响。结果 :9种不同来源的人肿瘤细胞系均不同程度表达CD137L ,其中 ,BEL 74 0 2、HL 6 0、A2细胞系呈高水平表达 ;HepG2 .2 .15、L 78、HT 2 9细胞系中度表达 ;U937、H6、HLE细胞系低表达。胚胎细胞系ECV 30 4中度表达 ,而新分离的正常外周血单个核细胞不表达。CD137L的表达水平与肿瘤细胞系的来源无关 ,同一组织来源的细胞系 ,有的高表达 ,有的低表达。肿瘤细胞上的CD137L对肿瘤细胞本身IL 8的分泌可产生不同的影响 :可使HepG2 .2 .15分泌IL 8的水平增加 ,但对HLE、A2 ,只能微弱地增强肿瘤细胞释放IL 8。结论 :CD137L在肿瘤细胞上的表达是普遍现象 ,其表达可能与细胞的快速生长有关 ;肿瘤细胞的CD137L可增强某些细胞系分泌IL 8。     

新的抑癌基因PDCD4最新研究进展

目的:程序性细胞死亡4(PDCD4)是一种新的细胞凋亡相关基因,最近来自动物和人类肿瘤的研究显示 PDCD4可能是一种新的抑癌基因,在肿瘤的发生、发展中可能发挥重要作用。本文从该基因的发现、生物学特点以及与肿瘤发生、发展的关系进行了综述。     

菟丝子丸治疗糖尿病并发症20例

糖尿病为肺、脾、肾之脏致病,其中肾为根本。肾气虚,气化不利,固摄无权,故小便频数。采用菟丝子丸补肾固摄、养心安神之法治疗,疗效明显。