鼠抗人OX40功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的：研制功能性鼠抗人OX40单克隆抗体。方法：以转人OX40的转基因细胞L929-OX40为免疫原，常规免疫6—8周龄的雌性BALB／c小鼠；采用B淋巴细胞融合技术，将免疫小鼠脾脏细胞与SP2／0融合，以L929-OX40转基因细胞及PHA活化的T细胞为抗体筛选阳性细胞，经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养；采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该单抗的亚类及抗原识别位点；采用MTT法分析单抗在体外对T细胞的促增殖效应以及ELISA分析活化T细胞分泌的细胞因子。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7E11)，该单抗能特异性地识别人OX40分子和介导有效的共刺激信号，体外促进活化的T细胞增殖和细胞因子的分泌。结论：成功研制成一株能分泌功能性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤，该抗体特异性地识别人OX40分子并具有在体外协同刺激T细胞的作用。     

慢性肾炎患者外周血共刺激分子CD28和CD137水平变化研究

目的　研究慢性肾炎患者外周血共刺激分子CD2 8和CD1 37的表达特点及其在慢性肾炎免疫病理机制中的作用。方法　采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析 ,对 5 2例慢性肾炎患者外周血共刺激分子CD2 8、CD1 37和T淋巴细胞亚群的表达进行检测。结果　慢性肾炎患者T细胞亚群明显失衡 ,表现为CD4减少 ,CD8增加 ,CD4 CD8比值显著降低。共刺激分子CD2 8表达显著低于正常对照组 (P <0 0 1) ,且CD+4 CD+2 8T细胞和CD+8CD+2 8T细胞均显著减少 (P <0 0 1)。共刺激分子CD1 37表达显著高于正常对照组 (P <0 0 1)。结论　慢性肾炎患者外周血T细胞亚群失衡和T细胞活化所必需的共刺激分子CD2 8、CD1 37异常表达 ,可能在慢性肾炎发生和病变进展中起着重要作用     

CD40激发对恶性B淋巴细胞体外生物学行为的影响

目的 观察重组人可溶性CD40配体（rhsCD40L)及CD40L基因转染细胞（CD40L-TC）对恶性B淋巴细胞体外生物学行为的影响，探讨rhsCD40L在肿瘤生物治疗中的可能作用。方法 利用基因工程技术获得了rhsCD40L和CD40L-TC，分别与恶性B淋巴细胞株XG2，XG7，U266，8226，Raji及Daudi共同作用，分析了CD40激发对肿瘤细胞的体外增殖（锥虫蓝计数法），细胞周期（碘化丙锭掺入法），细胞表面共刺激分子的表达（免疫荧光标记法）以及细胞凋亡（Anexin-V-ETTC法）的效应。结果 （1）恶性B淋巴细胞株CD40表达呈异质性，XG2高表达CD40，8266，Raji和Daudi中度表达，而XG7和U266不表达CD40。显微镜下观察发现，rhsCD40L(5μg/ml）可引起XG2或Daudi细胞的同型聚集，该效应在作用6-8h后即可出现；与CD40L-TC细胞共育后（肿瘤细胞；CD40L-TC=5：1），XG2，Raji和Daudi细胞可粘附于CD40L-TC表面；（2）rhsCD40L和CD40L-TC均可显著抑制XG2，Raji和Daudi细胞的体外增殖，导致XG2细胞呈现G1期阻滞，而Raji和Daudi细胞阻滞于G2期，并诱导XG2，Raji,Daudi细胞的凋亡，凋亡率分别为：XG2细胞23.3%和18.8%,Raji细胞阻滞于G2期，并诱导XG2，Raji,Daudi细胞的凋亡，凋亡率分别为：XG2细胞23.3%和18.8%,Raji细胞11.6%和8.9%,Daudi14.2%和15.9%;(3)表型分析显示；rhsCD40L/CD40L-TC可明显上调XG2,Raji和Daudi细胞CD95的表达水平以及Raji细胞CD80的表达，而下调Raji细胞CD18的表达。结论 rhsCD40L能直接并显著地抑制恶性B淋巴瘤细胞株Raji,Daudi和多发性骨髓瘤细胞株XG2的体外增殖，诱导其凋亡，并上调Raji细胞免疫共刺激株Raji,Daudi和多发性骨髓瘤细胞株XG2的体外增殖，诱导其凋亡，并上调Raji细胞免疫共刺激分子CD80的表达，具有膜型CD40L的同样生物学功能，故rhsCD40L具有潜在的抗恶性B淋巴细胞肿瘤的作用。     

基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4在自体外周血造血干细胞动员中的表达及临床意义

目的探讨基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4(SDF-1/CXCR4)在自体外周血造血干细胞动员中的表达及意义。方法采用免疫荧光标记和流式细胞仪表型检测分析CD3 4细胞上CXCR4的表达;ELISA方法动态分析患者造血干细胞动员过程中血浆中SDF-1水平的变化。结果①采集物中CD3 4CXCR4 细胞较动员前外周血和骨髓中CD3 4CXCR4 细胞均显著减少,分别为:(22.4±10.92)%,(32.09±12.71)%,(59.07%±26.98)%,P(0.01;动员好的组CD3 4CX-CR4 细胞数(20.11±8.87)%较动员差的组CD3 4CXCR4 细胞数(27.79±12.71)低,但无统计学意义(P=1.21)②血浆SDF-1至采集干细胞时显著降低;动员好的组血浆SDF-1平均含量显著低于动员差的组(P(0.001)。结论在造血动员过程中,SDF-1/CXCR4信号的表达是逐渐下调的,血浆SDF-1含量显著降低者动员效果好。     

过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞共刺激分子B7-1、B7-2与CD28的表达及意义

目的 探讨免疫共刺激分子B7-1、B7-2和CD28在过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞（PBMc）中的表达及其意义。方法 应用流式细胞仪（FCM）从蛋白质水平检测了38例过敏性紫癜（HSP）患儿（其中11例诊断为紫癜性肾炎）和20例正常儿童PBMC中B7-1、B7-2和CD28的表达，并分析其与24h尿微量白蛋白的关系。结果 过敏性紫癜患儿B7-2蛋白和CD28蛋白的表达水平（相对平均荧光强度，RMFI）均高于正常对照组（P〈0．05），各组间B7-1蛋白表达水平的差别无显著性意义（P〉O．05）。18例24h尿微量白蛋白（24hUMA）增高的HSP患儿共刺激分子B7-2、CD28蛋白的表达与24hUMA呈等级正相关。结论 过敏性紫癜患儿PBMC共刺激分子B7-2、CD28表达异常增加，可能参与HSP的起病，而且B7～2、CD28蛋白的表达与24h尿微量白蛋白呈等级正相关，提示可以作为监测HSP患儿病情以及检测早期肾脏损害的免疫学指标。     

慢性肾小球肾炎患者外周血CD28/B7水平表达及其临床意义

目的 观察慢性肾小球肾炎患者外周血共刺激分子CD28／B7的表达特点，以期探讨其在肾小球肾炎发病机制中的作用。方法 采用流式细胞仪，对25例慢性肾小球肾炎患者和15例正常对照组外周血CD3，CD4，CD8，CD28，CD4CD28，CD8CD28，B7的表达进行了研究。结果 25例慢性肾小球肾炎患者CD3水平与正常对照组相比无明显差异（P＞0．05），而CD4，CD28，CD4CD28，CD8CD28表达水平显著低于正常对照组，CD8，B7表达水平显著高于正常对照组。结论 慢性肾小球肾炎中，细胞免疫功能异常，尤其是共刺激分子CD28／B7异常在其发病过程中起着重要作用。     

分泌独特型免疫球蛋白BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤模型的建立

目的： 构建分泌独特型免疫球蛋白(idiotype, Id) 的BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤细胞株，建立动物模型，为进一步开展Id树突状细胞(dendritic cell, DC)疫苗的免疫治疗提供物质基础。 方法： 采用降植烷和不完全弗氏佐剂间隔致敏6～8周龄BALB/c小鼠，继而采用细胞融合技术、ELISA法、免疫荧光标记和流式细胞术(flow cytometry, FCM) 筛选获得分泌Id的阳性克隆；体内诱生腹水和体外无血清培养法制备Id，优球蛋白沉淀法结合凝胶Suphecray200过滤纯化Id；建立荷瘤模型，从荷瘤小鼠骨髓前体细胞诱导DC。 结果：获得2株稳定分泌Id的BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤细胞SB4和SB5，Id均为IgM/κ；成瘤率均为100%，荷瘤小鼠平均生存期为（30±4） d。 结论： SB4和SB5能持续稳定分泌非自身反应性Id，具有良好的成瘤性和高转移率。     

转染人CXCR4细胞株的构建及其生物学功能的研究

目的：构建稳定表达人CXCR4基因的L929细胞株，分析CXCR4分子对转基因细胞迁移能力的影响。方法：TRIzol一步法抽提人外周血单个核细胞（PBMC）总RNA，RTPCR扩增出CXCR4基因，双酶切装入逆转录病毒载体pEGZTerm，与辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T，用其培养上清感染L929细胞72h后，经Zeocin筛选出稳定表达CXCR4分子的L929细胞株；利用微孔隔离小室检测转人CXCR4基因的L929细胞在SDF-1α作用下的迁移能力。结果：构建含CXCR4基因的重组逆转录病毒载体，经转染包装细胞293T后，筛选获得能稳定高表达人CXCR4蛋白的L929转基因细胞，转入人CXCR4基因的L929细胞在SDF-1α作用下介导迁移。结论：成功构建转染人CXCR4细胞株，为肿瘤迁移模型的研究和鼠抗人CXCR4 mAb的制备打下基础。     

鼠抗人多聚体蛋白聚糖单克隆抗体对骨髓瘤细胞株生长的抑制作用

目的研究多聚体蛋白聚糖(syndecan-1,CD138)单克隆抗体(mAb)4B3对天然表达syndecan-1的人多发性骨髓瘤(MM)细胞XC-1和XG-2的生物学效应。方法采用间接免疫荧光标记和流式细胞术分析,通过4B3mAb观察XC-1和XC-2细胞膜上syndecan-1荧光标记阳性率;按常规培养方式对XC-1、XG-2进行细胞培养和台盼蓝染色记数,观察不同浓度的4B3mAb对XC-1和XG-2细胞体外生长作用。结果4B3mAb能识别XG-1和XG-2细胞表达的syndecan-1分子,表达率与商品化的鼠抗人syndecan-1 mAb(BB4)相似;同时,4133mAb与XG-1和XG-2细胞膜上syndecan-1荧光标记阳性率基本一致,反应均呈强阳性;加入不同浓度的4B3mAb,XC-1细胞数量2d后开始下降,而XG-2细胞3d后数量出现减少。结论4B3mAb抗体对XC-1和XG-2均具有明显的生长抑制作用,但XG-2细胞的生长抑制作用早于XC-1,可为MM的生物治疗提供新途径。     

肿瘤细胞冻融裂解物上清对凋亡细胞负载的树突状细胞生物学特性的作用研究

目的:探讨Balb/c小鼠骨髓瘤SP2/0细胞冻融裂解物上清对SP2/0凋亡细胞负载的骨髓来源的树突状细胞(DC)的成熟、生物学特性及功能的影响。方法: 采用小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导骨髓来源的DC, 100Gyγ射线辐照诱导SP2/0细胞凋亡, 与未成熟DC共育16-20h;SP2/0细胞冻融裂解物上清和脂多糖(LPS)分别作用于DC48h。采用免疫荧光标记和流式细胞术分析DC表型;[³H]-TdR掺入试验和[⁵¹Cr]释放试验测定DC刺激T细胞增殖和细胞杀伤效应。采用腹股沟皮下DC主动免疫治疗SP2/0荷瘤小鼠, 每间隔14d治疗1次, 共3个疗程, 观察肿瘤生长情况及小鼠生存期。结果:(1)经SP2/0冻融裂解物上清和脂多糖(LPS)诱导凋亡肿瘤细胞负载的DC高表达共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子, 但抗原摄取能力均下降;(2)SP2/0冻融裂解物上清组和LPS组DC体外刺激T细胞增殖和激活CTL能力均高于对照组(P＜0.05);(3)经SP2/0冻融裂解物上清组主动免疫治疗小鼠存活期长于其它各组(P＜0.05)。结论:小鼠SP2/0细胞冻融裂解物上清可诱导凋亡细胞负载的树突状细胞成熟, 能够刺激T细胞增殖和激发肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL), 主动免疫治疗可激发荷瘤小鼠体内有效的肿瘤特异性免疫力, 延长荷瘤小鼠生存期。