顺铂在TRAIL/APO-2L致胶质瘤细胞凋亡作用中影响机制的研究

目的探讨TRAIL对胶质瘤细胞凋亡的影响,并进一步研究DNA破坏药物顺铂(CDDP)在与其联合作用诱导细胞凋亡中影响作用的机制。方法行人脑胶质瘤U251细胞株的培养,应用不同浓度TRAIL和CDDP作用于胶质瘤U251细胞,MTT法检测TRAIL和CDDP分别及联合作用于U251细胞后的存活率,并以亚毒剂量的TRAIL和CDDP联合作用后,流式细胞仪检测其凋亡率。Westernblot方法检测CDDP作用前后TRAIL受体DR5表达量的变化。结果MTT结果:在一定时间范围内,随着药物浓度增加,TRAIL和CDDP分别及联合作用皆使胶质瘤U251细胞存活率逐渐降低,其中两者的联合作用效果明显,与分别作用组差异有统计学意义(P<0.01)。亚毒剂量的TRAIL(50ng·ml-1)、CDDP(4μg·ml-1)分别及联合作用人脑胶质瘤U251细胞24h后,存活率分别为:72.43%,75.56%,23.45%。亚毒剂量的TRAIL(50ng·ml-1)、CDDP(4μg·ml-1)单独或联合作用组致胶质瘤细胞凋亡率分别为25.61%、20.59%、62.33%。单独应用组与联合组之间差异有统计学意义(P<0.01)。Westernblot法检测显示:CDDP作用后较作用前DR5表达有明显增高,随CDDP剂量增多,DR5表达量逐渐增加。结论TRAIL和CDDP联合作用能显著增强其对人U251胶质瘤细胞凋亡的诱导,其机制可能与CDDP能上调TRAIL死亡受体DR5的表达有关。     

去甲基药、化疗药及TRAIL联合诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究

目的探讨去甲基药5-氮杂胞苷、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及化疗药联合诱导神经母细胞瘤细胞株SH-SYSY（SYSY）凋亡的作用及其发生机制。方法应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测5-氮杂胞苷作用前后SYSY细胞caspase-8的表达；应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法及流式细胞仪检测TRAIL、5-氮杂胞苷＋TRAIL、5-氮杂胞苷＋caspase-8抑制剂zIETD-FMK＋TRAIL及5-氮杂胞苷＋化疗药＋TRAIL对SYSY细胞生长及凋亡的影响。结果SYSY细胞不表达caspase-8，5-氮杂胞苷作用1、3、5、7d的SY5Y细胞caspase-8表达逐渐增加。SY5Y细胞对TRAIL不敏感，经5-氮杂胞苷诱导表达caspase-8的SY5Y细胞对TRAIL敏感；化疗药可增强SYSY细胞对TRAIL的敏感性。结论5-氮杂胞苷可通过上调SYSY细胞caspase-8表达而逆转SYSY细胞对TRAIL诱导凋亡的耐受，化疗药可进一步增强TRAIL对SYSY细胞的诱导凋亡作用。     

核酶诱导神经母细胞瘤凋亡的实验研究

目的 研究抗Bcl-2mRNA的锤头型核酶（RibozymeRZ)基因诱导神经母细胞瘤（SK－N－SH）凋亡以及增强化疗药物顺铂的敏感性,方法（1）应用电穿孔法,分别将整合有抗Bcl02mRNA核酶的缺陷性逆转录病毒载体pDOR-RZ和空载体pDOR-neo导入SK－N－SH细胞,（2）用免疫组化和间接免疫荧光染色法观察Bcl-2蛋白表达。（3）用流式细胞仪（FCM）检测细胞调率及细胞周期的变化。（4）电镜观察转染细胞形态变化。结果 （1）转染RZ组Bcl-2蛋白合成受到抑制,（2）细胞周期显示,转染RZ组可见凋亡峰,发生Go/G1期阻滞,电镜观察呈典型的凋亡形态改变。（3）顺铂增敏试验表明顺铂对转RZ组杀伤作用增强。结论 逆转录病毒介导的抗Bcl-2核酶基因可抑制肿瘤细胞内Bcl-2蛋白的合成,促进瘤细胞凋亡,并可增强其对化疗药物顺铂的敏感性。     

三氧化二砷诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡作用的研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)及其联合地塞米松(DEX)诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡的作用。方法实验分为空白对照组、As2O3组、DEX组、As2O3 DEX组,经倒置显微镜观察、吖啶橙荧光染色、流式细胞计数、细胞DNA片段断裂率来检测As2O3及其联合DEX诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡的作用。结果As2O3以浓度依赖形式诱导BT-325细胞凋亡;DEX具有明显的协同效应。结论As2O3与DEX联合用药可能成为治疗胶质母细胞瘤的一条新途径。     

ArdipusillosideⅠ诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡实验研究

目的研究开发诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡的新型抗肿瘤药物并探讨其机制。方法以U87MG、原代培养的人源性胶质母细胞瘤株和SVGp12细胞为研究对象,采用甲基噻唑基四唑（MTF）法检测ardipusilloside Ⅰ作用后细胞的增殖活性,通过流式细胞仪分析细胞周期,Hoechst33342细胞核染色,透射电子显微镜观察ardipusillosideⅠ作用后细胞形态学的改变。Western blot检测细胞内FasL、Fas、caspase-8和caspase-3的蛋白表达情况。结果ArdipusillosideⅠ以时间和浓度依赖的方式显著抑制了人胶质母细胞瘤U87MG细胞和原代培养人源性胶质母细胞瘤细胞的增殖活性。随着时间的延长和浓度梯度的增加,处理组逐渐显示出典型的凋亡细胞形态学特征。ArdipusillosideⅠ明显地改变了胶质母细胞瘤的细胞周期。结论ArdipusillosideⅠ成功诱导了人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞和原代培养的人源性胶质母细胞瘤细胞发生凋亡。     

IFN-γ增强细胞毒类药物对神经母细胞瘤的诱导凋亡作用

目的探讨细胞毒类药物对神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y（SY5Y）细胞的作用及γ-干扰素（IFN-γ）对其抗瘤活性的影响。方法应用逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测IFN-γ作用前后半胱-天冬氨酸蛋白酶8（Caspase8）mRNA的表达;应用流式细胞仪检测细胞毒类药物[阿霉素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）]及IFN-γ联合细胞毒类药物对SY5Y细胞的诱导凋亡作用;应用比色法测定Caspase8相对活性。结果SY5Y细胞不表达Caspase8,经IFN-γ作用后Caspase8mRNA表达明显增加。SY5Y细胞对阿霉素相对敏感,对TNF-α和TRAIL不敏感;经IFN-γ预处理后,表达Caspase8的SY5Y细胞对三种细胞毒类药物的诱导凋亡作用敏感并伴随Caspase8活性增高,此作用可被Caspase8抑制剂所阻断。结论IFN-γ通过上调Caspase8表达而增强细胞毒类药物对神经母细胞瘤细胞的诱导凋亡作用。     

组织因子表达下调影响阿霉素诱导人胶质母细胞瘤细胞凋亡的研究

目的研究组织因子（TF）对阿霉素诱导人胶质母细胞瘤细胞凋亡的影响。方法以免疫印迹法检测TF表达。分子生物学方法构建TFsiRNA-pSUPER表达载体,以脂质体介导进行基因转染。以水溶性四唑盐法检测阿霉素的细胞毒性。以印迹法检测阿霉素诱导的Caspase-3、PARP的裂解。以Hochest33342染色荧光显微镜检测凋亡细胞。结果人胶质母细胞瘤细胞系U373MG高表达TF。转染TFsiRNA-pSUPER表达载体的U373MG细胞及对照细胞分别以阿霉素处理,可见转染细胞较对照细胞Caspase-3、PARP的裂解增强。以不同浓度阿霉素处理48h后,可见转染后的U373MG细胞的存活数较对照细胞明显减少（P〈0.05）。以Hochest33342染色检测到转染后的U373MG细胞经阿霉素处理后的凋亡细胞数显著增多（P〈0.05）。结论人胶质母细胞瘤U373MG中TF异常高表达的下调,可增强阿霉素诱导的细胞凋亡。肿瘤细胞中TF的异常高表达可能影响肿瘤细胞对化疗药物的耐受性。     

TRAIL对原代培养胶质瘤细胞的凋亡诱导作用

目的研究TRAIL对原代培养的胶质瘤细胞的凋亡诱导作用,探讨其临床应用的实际价值。方法对22例脑胶质瘤和5例正常脑组织进行原代培养,用流式细胞仪检测TRAIL作用后肿瘤细胞和正常胶质细胞的凋亡率。结果成功培养出18例胶质瘤细胞和4例正常胶质细胞。800ng mlTRAIL作用48h后,凋亡率在80%以上的5例,50%～80%9例,50%以上14例,占总数的77.78%,50%以下的4例;正常胶质细胞无明显凋亡发生。结论TRAIL能有效地选择性地杀死某些胶质瘤细胞,对正常胶质细胞则无损害作用,TRAIL为胶质瘤的安全治疗提供了一个新的备选方法。     

TRAIL对原代培养胶质瘤细胞的凋亡诱导作用

目的研究TRAIL对原代培养的胶质瘤细胞的凋亡诱导作用，探讨其临床应用的实际价值。方法对22例脑胶质瘤和5例正常脑组织进行原代培养，用流式细胞仪检测TRAIL作用后肿瘤细胞和正常肢质细胞的凋亡率。结果成功培养出18例胶质瘤细胞和4例正常胶质细胞。800ng／ml,TRAIL作用48h后，凋亡率在80％以上的5例，50％。80％ 9例。50％以上14例．占总数的77．78％，50％以下的4例；正常胶质细胞无明显凋亡发生。结论TRAIL能有效地选择性地杀死某些胶质瘤细胞，对正常胶质细胞则无损害作用，TRAIL为肢质瘤的安全治疗提供了一个新的备选方法。     

放线菌素D和替尼泊甙对大鼠胶质瘤细胞增殖影响的实验研究

目的研究放线菌素D（Actinomycin D，ACTD）和替尼泊甙（Teniposide，VM-26）对大鼠胶质瘤细胞增殖的影响。方法应用免疫细胞化学方法，观察C6细胞经不同剂量ACTD和VM-26作用48h后PCNA、CyclinD1表达的改变，FCM法分析细胞凋亡；流式细胞术分析细胞周期变化，3H—TdR掺人法分析细胞增殖。结果对照组PCNA和CyclinD1均为强阳性；经放线菌素与VM-26作用后，PCNA和CyclinD1表达均受到显著的抑制，尤以放线菌素D组效果最佳，与对照组比较差别显著，FCM法发现C6组几乎没有凋亡细胞，高浓度的ACTD和VM-26组的凋亡率明显增加（x^2=63．714，P〈0．01）；流式细胞分析发现ACTD和VM-26组S期指数较对照细胞明显减少，3H—TdR掺人法发现与C6组比较，ACTD和VM-26组48h存活率均明显下降，且两者之间存活率也有明显差异（x^2=52．223，P〈0．01）；以ACTD组下降最显著。结论放线菌素D可显著抑制胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡，可以成为胶质瘤化疗的一种新策略，值得进一步进行体内实验。     

TRAIL参与氧合血红蛋白诱导的脑血管内皮细胞凋亡

目的目前对自发性蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛（CVS）的机制尚不十分清楚,研究认为脑血管内皮细胞的凋亡发挥了重要作用。本实验探讨了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及caspase3在血管内皮细胞凋亡中作用。方法在离体培养的脑血管内皮细胞中,观察给予氧合血红蛋白（OxyHb）处理以及给予caspase3拮抗剂或TRAIL后,运用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）和Western blot检测两者在mRNA和蛋白水平表达的改变。结果和生理盐水阴性对照相比,单纯OxyHb处理以及OxyHb＋TRAIL处理后,血管内皮caspase3表达均显著升高（P〈0．05）。TRAIL能够上调OxyHb刺激诱导的caspase3表达（P〈0．05）。和生理盐水对照组相比,OxyHb处理后,血管内皮TRAIL表达显著上调（P〈0．05）。但是,和OxyHb处理相比,caspase3拮抗剂Ac—DEVD—CHO（ADC）不能明显改变OxyHb刺激诱导的TRAIL蛋白的表达上调（P〉0．05）。结论TRAIL能够促进SAH后OxyHb刺激导致的内皮细胞凋亡。在凋亡的级联反应过程中,TRAIL能够活化下游caspase3,从而启动凋亡过程。因此,TRAIL及其受体在SAH后CVS的发生、发展过程中可能有着重要作用。     

外源性TRAIL基因转染联合氯喹诱导胶质瘤U251细胞凋亡

目的探讨外源性肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体(TRAIL)联合氯喹对U251细胞凋亡的作用。方法构建稳定表达TRAIL的质粒p EGFP-TRAIL,然后转染到胶质瘤细胞系U251细胞中(TRAIL组),以p EGFP-C1质粒为阴性对照,以不转染质粒为空白对照;将氯喹(50μmol/L)加入到转染p EGFP-TRAIL质粒U251细胞培养基中,作为联合组。共聚焦显微镜检测GFP-TRAIL蛋白表达,MTT法检测细胞抑制率,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,免疫印迹法检测GFP-TRAIL和Cleaved caspases-8蛋白表达。结果质粒转染后,共聚焦荧光显微镜检测结果显示,p EGFP-C1在细胞质中成弥散分布;而GFP-TRAIL在细胞质中成聚点分布,且荧光表达可以持续48 h以上;免疫印迹法分析结果显示TRAIL组TRAIL蛋白表达水平明显高于空白对照组和阴性对照组(P0.05)。联合组细胞增殖抑制率[(47.22±0.15)%]明显高于阴性对照组[(3.21±0.04)%,P0.05]和TRAIL组[(23.88±0.22)%,P0.05]。联合组细胞凋亡率[(41.62±0.44)%]明显高于空白对照组[(2.14±0.09)%,P0.05]、阴性对照组[(3.46±0.17)%,P0.05]和TRAIL组[(22.48±0.43)%,P0.05]。联合组Cleaved caspases-8蛋白表达水平明显高于阴性对照组、TRAIL组(P0.05)。结论外源性TRAIL基因转染后可以在细胞中稳定表达并诱导细胞凋亡,与氯喹联合应用可以增强TRAIL诱导的细胞凋亡,其机制可能是氯喹抑制细胞自噬。     

TRAIL联合美伐他汀增强对SWO-38细胞的抑瘤作用及其机制研究

目的 探讨肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)单独或联合美伐他汀对人胶质瘤细胞SWO-38增殖和凋亡的影响及其作用机制. 方法 人胶质瘤细胞SWO-38分别用人重组可溶性TRAIL蛋白(rsTRAIL)、美伐他汀及两者联用处理;MTT法检测细胞增殖情况;双染色流式细胞仪检测细胞凋亡情况;间接免疫荧光染色结合流式细胞技术检测细胞表面TRAIL R_1/DR_4和TRAIL R_2/DR_5分子表达;RT-PCR方法检测TRAIL R_1/DR_4和TRAIL R_2/DR_5 mRNA表达. 结果 rsTRAⅡ,和美伐他汀在单用或联用时均可抑制SWO-38细胞增殖,诱导其凋亡,并在一定范围内呈时间、剂量依赖性;联合用药组细胞增殖抑制率和凋亡率明显高于单用rsTRAIL或美伐他汀组,比较差异有统计学意义(P<0.05).美伐他汀单独或联合rsTRAIL作用于SWO-38细胞72 h后,死亡受体TRAIL R_1/DR_4和TRAIL R_2/DR_5在细胞表面的表达明显较对照组细胞增强,其mRNA表达水平亦相应增加,比较差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 rsTRAIL与美伐他汀联合使用可增强对人胶质瘤细胞SWO-38的增殖抑制和凋亡诱导效应,其机制可能是美伐他汀增加SWO-38细胞TRAIL R_1/DR_4和TRAIL R_2/DR_5 mRNA表达、上调细胞表面TRAIL死亡受体从而增加其对rsTRAIL的敏感性.     

20008/肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体联合美伐他汀增加对人胶质瘤细胞SWO-38的抑瘤作用及其机制

目的 研究肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand,TRAIL)单独或联合美伐他汀(mevastatin)对人胶质瘤SWO-38细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法 人胶质瘤SWO-38细胞株以人重组可溶性TRAIL蛋白(human recombinant soluble TRAIL,rsTRAIL)、美伐他汀及两者联用处理;用MTT法检测细胞增殖;用双染色流式细胞仪检测细胞凋亡;用间接免疫荧光染色结合流式细胞技术检测细胞表面TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5分子表达;RT-PCR方法检测TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5 mRNA表达。 结果 rsTRAIL和美伐他汀在单用或联用时均可以抑制SWO-38细胞增殖,并在一定范围内呈时间、剂量依赖性;联合用药组抑制率显著高于单用rsTRAIL或美伐他汀组(P<0.01)。rsTRAIL和美伐他汀在单用或联用时均可以诱导SWO-38细胞凋亡,联合用药组细胞凋亡率显著高于单用rsTRAIL或美伐他汀组(P<0.01)。美伐他汀单独或联合rsTRAIL作用于SWO-38细胞72h后,死亡受体TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5在细胞表面的表达明显上调(P<0.01),其mRNA表达水平亦相应增加(P<0.01)。 结论 rsTRAIL与美伐他汀均对人胶质瘤SWO-38细胞具有一定的增殖抑制和凋亡诱导效应,而两者联合使用可以增强这种抗瘤效应,其机制可能是美伐他汀增加SWO-38细胞TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5 mRNA表达、上调细胞表面TRAIL死亡受体从而增加其对rsTRAIL的敏感性。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导胶质瘤细胞凋亡机制研究

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导胶质瘤细胞凋亡的机制.方法 以人重组可溶性TRAIL蛋白(rsTRAIL)处理人胶质瘤细胞U87;AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡;DiOC6荧光染色流式细胞术检测细胞线粒体跨膜电位(△ψm);比色法测定细胞caspase-3、8、9活性的变化;ELISA法检测胞浆cytC浓度;观察caspase-8阻断剂(Z-IETD-fmk)对U87细胞凋亡、△ψm和caspase-3、8、9活性变化的影响. 结果 rsTRAIL以时间依赖方式诱导U87细胞凋亡.同时导致U87细胞△ψm进行性下降,caspase-3、8、9活性及胞浆内cyt C浓度升高:caspase-8阻断剂可明显减弱rsTRAIL对U87细胞的上述生物学效应. 结论 TRAU通过激活caspase-8间接启动线粒体凋亡途径诱导恶性胶质瘤细胞U87凋亡.     

TRAIL诱发人脑H4神经胶质瘤细胞凋亡的研究

目的研究TRAIL对H4神经胶质瘤细胞的凋亡诱导作用，并探讨其可能机制。方法利用显微镜、透射电镜、流式细胞仪，观察和检测TRAIL对传代培养的肿瘤细胞的凋亡诱导作用，用MTT法检测easpase-8抑制剂zIETD—fmk对TRAIL凋亡诱导作用的抑制情况。结果TRAIL作用后镜下可见到H4细胞凋亡的典型表现；在流式细胞仪检测PI荧光直方图上，出现典型的亚二倍体峰，随着作用时间的延长，H4细胞凋亡率明显增加；zIETD—fmk能显著抑制TRAIL对H4细胞的凋亡诱导作用。结论TRAIL可有效的诱导H4神经胶质瘤细胞凋亡；easpase-8在H4瘤细胞的凋亡过程发挥着重要作用，TRAIL可能是通过激活caspase系统而诱发H4瘤细胞凋亡的。     

TRAIL腺病毒增强胶质瘤对顺铂的化疗敏感性研究

目的 探讨TRAIL腺病毒增强胶质瘤对顺铂的化疗敏感性.方法 制备TRAIL腺病毒,转染胶质瘤U251,流式细胞仪和MTT法检测顺铂作用于U251细胞后各组细胞的凋亡率和增殖率.结果 本研究成功将腺病毒转染进胶质瘤U251细胞,其转染率为82.1%.TRAIL腺病毒转染胶质瘤U251 后,细胞凋亡率增加为(34.2±5.8),%细胞生长缓慢,基本上处于抑制状态.结论 TRAIL腺病毒能显著增强U251细胞对顺铂的敏感性,为胶质瘤的基因治疗提供了理论依据.

Abstract：

Objective To investigate the effect of adenovirus TRAIL on the sensitivity of glioma cells to DDP chemotherapy. Method The adenovirus TRAIL was prepared and transduced into U251 glioma cells. After DDP treatment, the apoptosis and viability of glioma cells were analyzed by FCM and MTT assays. Results The adenovirus could transduce into U251 cell with the efficiency of 82. 1 %. After adenovirus TRAIL transduction, the apoptosis rate of glioma cells was increased to ( 34. 2 ± 5. 8) % , and the cell proliferation was inhibited after DDP treatment Conclusions Adenovirus TRAIL could increase the apoptosis and sensitivity of glioma cells to chemotherapy,which may povide an ideal strategy for glioma cell gene theray.     

人突变型TRAIL体外诱导脑恶性胶质瘤细胞凋亡的研究

目的观察人突变型肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)体外诱导人脑胶质瘤细胞的凋亡作用。方法设计90个碱基突变的人TRAIL全长基因,分四段合成,然后拼接获得全长寡核苷酸,插入原核表达载体pGEX-2T,转化E.coliDH-5α,丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析法分离、纯化融合蛋白,凝血酶切得到单纯的TRAIL蛋白。MTT法和流式细胞仪定量分析纯化产物体外对人A172、U87、U251和鼠C6脑恶性胶质瘤细胞的凋亡作用。结果突变型TRAIL原核表达产物为可溶性,体外可明显诱导人A172、U87、U251脑胶质瘤细胞凋亡,而对C6鼠胶质瘤细胞无明确的凋亡诱导作用。结论原核表达突变型TRAIL在体外具有明显诱导脑胶质瘤细胞凋亡的作用。