肝豆状核变性基因表达蛋白的多克隆抗体制备和纯化

目的　制备并纯化肝豆状核变性（WD）基因表达蛋白的多克隆抗体,为进一步研究WD蛋白的结构和功能打下基础。方法　应用RT-PCR扩增目的基因,GST基因融合载体表达并纯化融合蛋白,Thrombin酶切并收集目的蛋白,免疫家兔,凝胶过滤层析纯化抗体血清中的lgG,ELISA检测抗体滴度和western blot检测抗体特异性。结果　本方法生产的抗体滴度达到了1:12500,特异性好。结论　我们应用该方法成功制备了Wilson病蛋白的多克隆抗体,为我们进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。     

EGFRvⅢ单链抗体治疗小鼠脑胶质瘤的研究

目的探讨表皮生长因子受体III型突变体单链抗体(EGFRvIIIscFv)对小鼠脑胶质瘤的治疗效果。方法人工合成EGFRvIIIscFv基因序列并构建到原核表达载体中,诱导表达重组蛋白,经电泳和western blotting鉴定;再通过纯化和复性,得到有功能的EGFRvIIIscFv;用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定抗体的亲和常数后,通过立体定向仪将其注射到胶质瘤小鼠的脑内,观察荷瘤鼠的生存期,免疫荧光法检测肿瘤血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果双酶切鉴定和测序结果证实人工合成的EGFRv Ⅲ scFv序列与基因数据库中完全一致;经过诱导表达,电泳显示重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达;western-blotting鉴定蛋白分子量为63kDa,与预期大小基本一致;该单链抗体亲和常数为0.203×10-8mol/L;将蛋白注射到荷瘤鼠的脑内,与对照组相比,实验组肿瘤VEGF表达量明显减少、荷瘤鼠中位生存期明显延长(P<0.01)。结论 EGFRvscFv重组蛋白可与EGFRvⅢ特异性结合;脑内注射EGFRvⅢscFv可明显降低胶质瘤血管形成,延长荷胶质瘤小鼠生存期。     

结节性硬化症与难治性癫痫相关基因的生物信息学分析

目的 用生物信息学方法探讨结节性硬化症与难治性癫痫的发病相关基因，为癫痫的基础研究和临床治疗提供新思路。 方法 从基因芯片公共数据库Gene Expression Omnibus(GEO)中下载结节性硬化症与难治性癫痫相关基因芯片数据，利用String、KEGG、Panther等在线分析软件对差异表达基因进行生物信息学分析。 结果 在100个差异表达基因所编码的蛋白中,有47个蛋白与其他蛋白存在相互作用关系，作用过程涉及多种生物学通路，与多个生物学过程和分子功能相关。 结论 结节性硬化症与难治性癫痫这二者发病是多种基因相互作用的结果，其中与GFAP、ANXA2和S100A 10等关系最为密切。     

兔抗人免疫相关鸟苷三磷酸酶基因多克隆抗体的制备与鉴定

目的：表达人免疫相关鸟苷三磷酸酶基因（IRGM）a全长融合蛋白,制备高质量的免抗人IRGM多克隆抗体。方法：将IRGMa全长cDNA片段分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-2和真核表达载体pCMV-myc,测序验证序列正确。在大肠埃希菌E．coliBL21中表达IRGMa／GST融合蛋白,用纯化的可溶性IRGMa／GST融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗人IRGM抗体,采用ELISA、免疫印迹和竞争抑制等多种方法验证其敏感度和特异度。结果：自制的兔抗人IRGM多克隆抗体的特异度和敏感度均较高,效价更高于市售抗体。结论：成功制备了免抗人IRGM多克隆抗体,为进一步的功能研究打下基础。     

人超极化激活环核苷酸门控通道1基因启动子区及蛋白的生物信息学分析

目的通过生物信息学预测分析人超极化激活环核苷酸门控通道1(Hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated channel 1,HCN1)基因的启动子区的序列特征、转录因子及其结合位点和蛋白质的理化性质、信号肽、亲疏水性、跨膜区域、蛋白结构、与之相互作用的蛋白质及功能,为研究HCN1基因的表达调控及其参与伴海马硬化内侧颞叶癫痫等相关疾病的发病机制奠定理论基础。方法通过Protparam、Protscale、TMHMM、SignalP 5.0、NetPhos 3.1、Swiss-Model、Promoter 2.0、AliBaba2.1和EMBOSS等生物软件和网站分析和预测人HCN1蛋白理化性质、结构功能、定位表达、系统进化关系、蛋白相互作用以及HCN1基因启动子、CpG岛及转录因子结合位点特征等。结果信息学的预测HCN1蛋白的进化分析表明,人与黑猩猩的遗传距离最小,亲缘关系最近。人HCN1蛋白是位于质膜上不稳定的亲水性蛋白,存在2个典型的跨膜螺旋区,预测该蛋白无信号肽及核定位序列。HCN1蛋白的二级结构主要为无规则卷曲及α-螺旋,且含有多个潜在的磷酸化位点。HCN1的本体论分析:细胞组成分析表明HCN1蛋白位于质膜(GO:0005886);分子功能表现为与环磷酸腺苷(cyclic Adenosine monophosphate, cAMP)结合(GO:0030552)和电压门控离子通道活性(GO:0005244),参与细胞对cAMP的反应过程(GO:0071320)和钾离子的跨膜运输(GO:0071805)。与人HCN1存在相互作用的10个蛋白,包括HCN2、HCN4、PEX5L、MARCH7、KCTD3、GNAT3、SHKBP1、KCNQ2、FLNA和NEDD4L。主要为参与离子跨膜转运的调节(GO:0034765)和钾离子的跨膜运输(GO:0071805)。HCN1基因定位于5p12,含有8个外显子和7个内含子。HCN1基因上游至5'侧翼共2 000 bp的核苷酸序列存在3个启动子区。启动子区序列中存在1个长度为158 bp的CpG岛,HCN1基因5'调控区存在1个CAAT盒及1个TATA盒。被两种软件同时预测到的HCN1基因启动子区的转录因子结合位点有19种,包括NF-κB、NF-1、AP-1、TBP、IRF-1、c-Ets-1、Elf-1、HNF-3、HNF-1、YY1、GATA-1、RXR-α、GR、AP-2αA、ENKTF-1、C/EBPβ、C/EBPα、c-Fos和c-Jun。结论分析结果为进一步研究HCN1在癫痫发生发展过程中的作用具有重要意义,启动子区的生物信息学分析能够提高基因启动子的研究效率,为后续实验构建HCN1基因启动子表达载体及鉴定启动子功能提供理论依据。     

新型骨形态发生蛋白2反转录病毒载体的构建及活性检测

背景：骨形态发生蛋白是一种具有潜在活性的蛋白质，当骨组织损伤时其迅速增加并活性的增强，与载体复合能修复动物骨缺损，但将其用做基因治疗的研究未见报道。 目的：构建表达重组人骨形态发生蛋白2基因的重组反转录病毒载体，探讨其在成骨细胞中的生物学作用。 方法：根据Genbank中人骨形态发生蛋白2基因序列设计并合成骨形态发生蛋白2特异性引物，高保真PCR扩增骨形态发生蛋白2基因，同源重组法将骨形态发生蛋白2 PCR片段连接与克隆载体pDNR-CMV，构成pDNR-CMV-BMP2，经酶切、PCR和测序鉴定后，将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和反转录病毒空质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组，构成反转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2，转染入包装细胞PT67进行病毒包装，并用NIH3T3细胞进行病毒滴度测定；将反转录病毒感染人成骨细胞，四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长变化，转染48 h后Western blotting检测骨形态发生蛋白2蛋白表达。 结果与结论：pDNR-CMV-BMP2质粒SalI和EcoRI双酶切、PCR及测序结果均正确，重组质粒pLP-LNCX-BMP2经氯霉素及蔗糖筛选得到的阳性克隆骨形态发生蛋白2 PCR结果阳性，酶切产物与预期相一致；病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后，G418筛选可得到稳定细胞克隆，其上清液中病毒滴度可达到5×108pfu；四甲基偶氮唑盐检测中反转录病毒组与正常对照组相比，72 h细胞抑制率无明显差别(P > 0.05)，转染48 h后Western blotting可见骨形态发生蛋白2蛋白高表达。结果说明，实验成功克隆了骨形态发生蛋白2基因并构建其反转录病毒表达载体。     

Cdc2基因敲低逆转录病毒载体设计与构建方法

目的设计和构建cdc2基因敲低的表达siRNA的逆转录病毒重组载体。方法利用在线软件siRNASelectionProgram和siDirect设计干扰cdc2基因靶序列,合成回文DNA序列,退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体扩增、抽提后行双酶切电泳鉴定和测序分析,再转染phoenix细胞,产生逆转录病毒,并利用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果pSUPER表达siRNA重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析,证实插入的60bp序列与原序列一致,位置正确。pSUPER.retro-C1、pSUPER.retro-C2病毒滴度值分别为4.25×105CFU/ml和6.00×105CFU/ml。结论cdc2基因表达siRNA逆转录病毒重组载体构建成功,可为研究胶质瘤分子病因学提供有用工具。     

阿尔茨海默病相关基因的生物信息学分析

目的 通过生物信息学方法探讨阿尔茨海默病的发病相关基因,为阿尔茨海默病的基础研究和临床治疗提供新思路. 方法 从基因芯片公共数据库GEO中下载阿尔茨海默病相关基因芯片数据,利用String、KEGG、Panther等在线分析软件对差异表达基因进行生物信息学分析. 结果 在34个差异表达基因所编码的蛋白中,有25个蛋白与其他蛋白存在相互作用关系;相互作用过程中涉及多种生物学通路,与多个生物学过程和分子功能相关. 结论 阿尔茨海默病是多种基因相互作用的结果,其中与钙离子信号相关基因关系较为密切.     

白细胞介素-2基因佐剂对单纯疱疹病毒糖蛋白D DNA疫苗的免疫增强作用

目的探讨自细胞介素-2（IL-2）基因佐剂对单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV—Ⅰ）糖蛋白D（gD）DNA疫苗的免疫调节作用。方法将表达HSV—Ⅰ gD基因的DNA疫苗质粒IRES-gD以及HSV-Ⅰ gD与IL-2基因共表达的重组质粒IRES-gD-IL-2分别注入BALB／c鼠股四头肌，检测特异性抗体和中和抗体的产生情况，并于第3次注射后14d用滴度100组织培养半数感染量（TCID50）的HSV—Ⅰ病毒感染小鼠，观察小鼠的生存情况。结果IRES-gD组和IRES-gD-IL-2组均可刺激小鼠产生抗HSV—Ⅰ gD的特异性抗体和中和抗体，抗体滴度随免疫次数增加而升高IRES-g D-IL-2组小鼠产生的抗体及中和抗体滴度明显高于IRES-gD组，两组小鼠的生存率差异无统计学意义。绪论IL-2基因佐剂可促进HSV—Ⅰ gD DNA疫苗诱导抗体的产生，并具有免疫增强作用。     

AChR-Fc融合蛋白靶向BCR选择性识别、清除AChR反应性B细胞

目的研究乙酰胆碱受体(AChR)-Fc融合蛋白选择性识别、清除AChR反应性B细胞的作用。方法克隆人AChRα1亚单位胞外段基因(Hα1-210),插入含有CMV启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgG1从铰链区到CH3基因片段的真核表达载体pAN1782中,构建重组表达载体pAN-Hα1-210,表达AChR-Fc融合蛋白;同分泌乙酰胆碱受体抗体(AChRAb)的杂交瘤细胞TIB175共孵育,采用流式细胞仪观察、分析AChR-Fc融合蛋白同杂交瘤细胞的亲和力以及对杂交瘤细胞增殖和凋亡的影响。结果成功构建真核表达载体pAN-Hα1-210,在CHO-K1细胞中稳定表达具有一定生物活性的AChR-Fc融合蛋白;AChR-Fc融合蛋白对TIB175细胞具有较高的亲和力,可特异性抑制该细胞的增殖并促进其凋亡。结论 AChR-Fc融合蛋白可特异性识别、清除AChR反应性B细胞,为进一步靶向B细胞治疗重症肌无力奠定基础。