生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞体外的生物相容性

背景：生物衍生骨材料已在临床应用多年，但其作为组织工程骨支架材料的可行性还需验证。 目的：评价异种生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞的生物相容性。 设计、时间及地点：单一样本体外观察性实验，于2007-08/2008-01在中国辐射防护研究院医用组织库组织工程实验室完成。 材料：山西省医用组织库生产的人松质骨；体外分离培养1周龄新西兰兔骨髓间充质干细胞。 方法：经脱脂、脱钙、去抗原等步骤制备生物衍生骨材料，扫描电镜观察其表面超微结构。直接贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，MTT法和流式细胞仪检测生物衍生骨材料对骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响。PKH26标记骨髓间充质干细胞与生物衍生骨材料复合培养，荧光显微镜动态观察细胞在骨材料上的生长情况；扫描电镜观察细胞在骨材料上的贴附、生长情况。 主要观察指标：①生物衍生骨材料的形态结构及骨髓间充质干细胞在其上的生长、增殖情况。②生物衍生骨材料的细胞毒性。 结果：所制备的生物衍生骨材料呈白色，扫描电镜观察呈规则的疏松多孔结构，孔隙间有微孔相互连通。其对骨髓间充质干细胞的增殖和凋亡无明显的影响；荧光显微镜下观察，在材料表面及孔隙内可见PKH26标记的细胞，显示红色荧光；扫描电镜观察可见细胞在材料上附着生长，细胞形态呈梭型或多角形，与材料贴附紧密。 结论：实验制备的异种生物衍生骨材料细胞毒性低，与骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性。     

增强型绿色荧光蛋白标记兔脂肪干细胞体外复合膀胱黏膜下层的生长特性

背景：绿色荧光蛋白作为细胞示踪标记已得到广泛应用,作者所查尚未见到以增强型绿色荧光蛋白作为标记方法用于研究脂肪干细胞与膀胱脱细胞基质复合后体外生长特性的报道。 目的：利用绿色荧光蛋白标记兔来源的脂肪干细胞,观察其作为种子细胞复合膀胱脱细胞基质体外培养的生长特性,为复合物回植体内时间提供参考。 设计、时间及地点：细胞标记示踪实验,于2009-01/05在上海组织工程研究与开发中心及上海第六人民医院实验动物房完成。 材料：取2只新西兰大白兔,制备膀胱脱细胞基质。取2只新西兰大白兔脂肪分离脂肪干细胞。 方法：体外培养增殖后脂肪干细胞转染增强型的绿色荧光蛋白,转染前后根据增殖速度,绘制生长曲线。然后将增强型绿色荧光蛋白转染的第3代脂肪干细胞以30×106的浓度接种于1 cm×1 cm 大小的膀胱脱细胞基质支架材料上培养。 主要观察指标：观察细胞转染后的生长特性,检测复合后的细胞总数,荧光显微镜观察复合后细胞形态。 结果：脂肪干细胞经转染后生长增殖速度未受明显影响。细胞DNA检测示复合培养7 d细胞增殖状态最佳。荧光显微镜观察显示培养7 d细胞增殖良好,10 d后呈现老化形态。 结论：增强型的绿色荧光蛋白转染不影响脂肪干细胞传代、增殖。脂肪干细胞-膀胱脱细胞基质复合物体外培养7 d左右回植较合适。     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景：动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞。 目的：观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达。 方法：采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化。 结果与结论：采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化。     

心脏瓣膜组织工程中理想种植细胞的来源比较

背景：现有的人工瓣膜,无论是机械瓣膜还是生物瓣膜,都存在与取材有关、无法从工艺制作方式改进解决的固有缺陷。组织工程心脏瓣膜概念的提出为解决该难题提供了新的方向。 目的：通过比较成熟分化血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞骨的获取手段、体外增殖能力以及在脱细胞基质上的生长情况,分析何者更适合作为制备组织工程人工心脏瓣膜的种植细胞。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2008-06/09在上海市胸科医院动物实验基地完成。 材料：用胰蛋白酶(胰酶)-EDTA、Triton X-100、DNase、RNase消化猪主动脉瓣膜获得脱细胞基质。从1只12 kg 2岁雄性杂交犬大隐静脉、股外侧动脉及肋骨骨髓获取种植细胞。 方法：用胰酶消化并收集内皮细胞,收集骨髓细胞,分别进行培养。通过贴壁法获得内皮细胞及骨髓间充质干细胞。利用内皮细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,并绘制细胞生长曲线。以抗Ⅷ因子抗体以及抗血管内皮生长因子抗体荧光染色,荧光显微镜观察。将细胞种植于脱细胞瓣膜上培养3 d后进行扫描电镜观察。 主要观察指标：①试验犬伤口愈合情况。②细胞培养、增殖情况。③骨髓来源骨髓间充质干细胞表型分析以及形态学观察。 结果：成熟血管内皮细胞体外增殖能力低下,骨髓间充质干细胞则增殖旺盛。生长曲线显示骨髓间充质干细胞的倍增时间约30 h,而成熟内皮细胞生长曲线平直。对骨髓间充质干细胞进行抗Ⅷ因子抗体以及抗VEGF抗体荧光染色,可见荧光染色阳性。扫描电镜见种植骨髓间充质干细胞的脱细胞瓣膜上散在星状细胞贴附。 结论：骨髓间充质干细胞体外增殖能力强,在内皮细胞生长因子诱导下可向内皮细胞转化,并可以生长贴附于脱细胞瓣膜,是作为组织工程人工心脏瓣膜制备的理想细胞来源。     

低强度脉冲式超声对兔脱细胞脱钙骨基质负载关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞复合体的影响*★

背景：有关低强度脉冲式超声波促进关节软骨损伤修复的研究较多，可供选择的细胞支架亦较多，但是有关低强度脉冲式超声波的应用条件及构建出理想的组织工程软骨细胞支架尚未达到共识。 目的：构建新西兰兔同种异体脱细胞脱钙骨基质负载关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞的复合体，给予一定条件的低强度脉冲式超声波刺激，以探讨脱细胞脱钙骨基质作为组织工程软骨支架的可行性和低强度脉冲式超声波刺激对关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞的促进作用。 设计、时间及地点：多个样本观察，实验于2009-05/08在解放军第二军医大学生物医学工程研究所完成。 材料：应用新型改良Urist法制备兔脱细胞脱钙骨基质。采用机械粉碎结合酶消化法获取兔关节软骨细胞；采用全骨髓漂洗法分离出骨髓间充质干细胞并加以纯化，进行体外单层培养扩增。 方法：按与脱细胞脱钙骨基质复合的细胞成分不同及是否应用低强度脉冲式超声波刺激不同分为4组：软骨细胞组、骨髓间充质干细胞组、复合细胞组：脱细胞脱钙骨基质分别与软骨细胞、骨髓间充质干细胞、软骨细胞/骨髓间充质干细胞复合，未进行低强度脉冲式超声波刺激。超声组：将脱细胞脱钙骨基质与软骨细胞/骨髓间充质干细胞复合，第2天进行低强度脉冲式超声波刺激，刺激频率1.0 MHz、瞬时空间强度10 mW/cm2，20 min/d。 主要观察指标：①平面培养第2代关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞行免疫组织化学检测。②新型改良Urist法制备的脱细胞脱钙骨基质行苏木精-伊红染色。③于细胞-支架复合第21天行Ⅱ型胶原的免疫组织化学检测。 结果：①平面培养第2代关节软骨细胞行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，可见细胞形态为多角形、星形、圆形，有伪足伸出，胞质内容丰富，胞浆明显呈棕黄色，胞核为圆形。②平面培养第2代骨髓间充质干细胞的CD34免疫组织化学染色呈阴性，CD44及CD105免疫组织化学染色呈阳性。③新型改良Urist法制备的兔脱细胞脱钙骨基质内未见明显的细胞样结构，空隙大小均匀。④复合第21天后，骨髓间充质干细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阴性，软骨细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色弱阳性，复合细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性，超声组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性。 结论：①第1~3代关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞与原代细胞的生物学性能相似。②在脱细胞脱钙骨基质内，软骨细胞和骨髓间充质干细胞可以保持较高的增殖能力。③10 mW/cm2的低强度脉冲式超声波不影响骨髓间充质干细胞活性，并且能够加速其向关节软骨细胞分化，但未发现有明显促进细胞增殖的作用。 关键词：组织工程；软骨细胞；骨髓间充质干细胞；脱细胞脱钙骨基质；低强度脉冲式超声波 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.47.002     

猪骨髓间充质干细胞体外诱导构建组织工程化软骨☆

目的: 如何修复气管缺损是一项医学难题，组织工程技术有望解决这一难题。要构建工程化气管软骨，种子细胞是关键因素之一。探讨利用组织工程方法,将猪骨髓间充质干细胞在体外诱导、培养后，构建软骨组织的可能性。 方法：实验于2006-10/2007-05在北京协和医院中心实验室完成。①实验材料：小型猪6只由中国农业大学提供，雌雄不限，体质量15~20 kg；聚羟基乙酸纤维（Equl.com.美国）。②实验过程及评估：抽取猪的胸骨骨髓, 经密度梯度离心法在体外进行分离、纯化，得到骨髓间充质干细胞, 并在含有转化生长因子β１的特定培养基内进行培养、诱导，免疫组织化学检测诱导细胞Ⅱ型胶原分泌。将诱导分化的骨髓间充质干细胞接种于聚羟基乙酸支架上，将其作为实验组；对照组为未接种细胞的单纯聚羟基乙酸支架；将两组标本环行包裹于直径为0.4 cm的离心管外表面，植入自体猪皮下，进行体内培养，分别于6，8，10周后取材，进行大体观察和组织学检测，评估工程化软骨的形成。 结果：①通过密度梯度离心法可获取骨髓间充质干细胞，对其进行培养扩增后可获得较多的细胞。②猪骨髓间充质干细胞通过特定的诱导后可向软骨细胞分化，诱导细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果为阳性。③猪骨髓间充质干细胞-聚羟基乙酸复合物经过体内第6，8，10周培养后,标本出现软骨组织外观,进行组织学切片可见软骨陷窝，Ⅱ型胶原蛋白的免疫组织化学检测为阳性。 结论：猪骨髓间充质干细胞在成软骨诱导剂作用下，经体外和体内培养后，可生成组织工程化软骨。     

羊膜脱细胞基质的制备及其生物相容性

目的：羊膜是一种天然的细胞外基质，具有抗原性低、排异反应小特点。实验拟进行羊膜脱细胞基质的制备，观察其作为组织工程支架材料的生物相容性。 方法：实验于2007-03/08在河北医科大学解剖教研室实验中心完成。实验材料：4～6周龄健康清洁级SD大鼠,体质量100～ 150 g，由河北医科大学实验动物中心提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。新鲜人羊膜取自石家庄市第四医院，采取前征得产妇知情同意，实验经医院伦理委员会批准。实验方法：①取新鲜人羊膜冲洗后以1%tritonX-100溶液振荡24 h，0.25%胰蛋白酶37 ℃振荡4 h，充分漂洗，冷冻干燥，环氧乙烷消毒，并进行苏木精-伊红染色和扫描电镜检测。②体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，并复合培养于羊膜脱细胞基质上，以不含细胞的培养基作为空白对照，以普通培养基培养作为阴性对照，倒置显微镜下观察生长情况，并进行苏木精-伊红检测。四甲基偶氮唑盐法测定羊膜脱细胞基质浸提掖对骨髓间充质干细胞毒性；将羊膜脱细胞基质植入SD大鼠背部皮下，检测其组织相容性。 结果：①制备的羊膜脱细胞基质为白色菲薄、半透明的膜状物，柔韧性好，经苏木精-伊红和扫描电镜检测无细胞残留。苏木精-伊红染色可见羊膜表面细胞黏附生长良好，细胞伸展，形态与正常培养细胞无差异。②实验组第2、4、6、8天的吸光度值低于对照组，相对增殖率随培养时间延长而增加，平均相对增殖率为89.5%，细胞毒性评分均为1级。③皮下埋置术后动物全部成活，伤口无红肿、渗液等炎症反应，移植物均未见坏死、纤维化等。光镜下，术后1周移植物周围可见以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，羊膜卷尚完整；术后2周，淋巴细胞减少，偶见新生毛细血管；术后4周，部分移植物已经降解，基本未见淋巴细胞。 结论：经去污剂和酶消化法制备的羊膜脱细胞基质生物相容性良好，是一种理想的组织工程支架材料。     

无细胞基质组织工程膀胱生物支架材料的生物力学特征

背景：前期研究表明，无细胞基质的组织工程膀胱支架材料有良好的生物相容性，无毒可吸收，符合组织工程生物支架材料的部分应用要求。 目的: 实验拟进一步观察无细胞基质组织工程膀胱生物支架材料的生物力学特性。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2006-07/2007-05在中国医学科学院北京协和医院中心实验室和北京大学高分子科学与工程系完成。 材料：新鲜猪膀胱。 方法:采用低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法对新鲜猪膀胱组织进行脱细胞处理，制备无细胞基质膀胱。对新鲜猪膀胱组织及制备的膀胱无细胞基质行苏木精-伊红染色和Masson染色。 主要观察指标：测定膀胱组织在脱细胞前后组织的厚度、组织含水量、可溶性蛋白含量、最大位移、最大应力和断裂应力。 结果: 与新鲜膀胱组织相比，脱细胞后的膀胱组织中未见有细胞成分，保留了完整的细胞外基质。膀胱组织含水量在脱细胞后明显增加（P < 0.001），组织厚度和可溶性蛋白含量明显降低，而经校正后的应力－应变参数及破坏强度则改变不明显。 结论:无细胞基质膀胱与天然组织的生物力学特性一致或接近。     

脱细胞血管基质制备及体内外生物相容性

背景：利用脱细胞血管基质作为血管支架具有以下优点：脱细胞血管基质保留了自然血管的复杂三维结构;脱细胞基质表面的生长因子和结构域有利于细胞的黏附和浸润。 目的：制备脱细胞血管基质并对其体内外生物相容性进行评价。 方法：采用胰蛋白酶、Triton X-100逐步处理猪颈动脉制备脱细胞血管基质。采用皮下植入实验、急性毒性实验和体外细胞毒性实验等评价其生物相容性。 结果与结论：脱细胞基质材料具有良好的化学稳定性,未释放对红细胞产生破坏溶解作用的有害元素,未引起急性溶血反应,对细胞的生长无毒性影响。脱细胞基质材料在动物体内植入后早期有较多炎性细胞浸润,到实验观察的后期无明显炎性细胞浸润,脱细胞基质内可见成纤维细胞。另外,脱细胞基质材料对周边组织未产生毒性作用,伤口Ⅰ期愈合。同时组织学切片显示：支架材料与周边组织相容性好,未产生排斥反应。说明脱细胞基质材料在动物体内具有很好的生物相容性。 关键词：血管支架;生物相容性;生物材料;脱细胞血管基质;相容性 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.16.010     

大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景：提供肝细胞生长因子的微环境可体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞。 目的：实验拟验证并简化成年大鼠骨髓间充质干细胞体外向肝细胞的诱导分化。 设计、时间及地点：观察实验，于2006-10/2008-05在北华大学完成。 材料：实验动物为成年SD大鼠，雌雄不限，体质量180~230 g。 方法：采用Percoll梯度离心方法获取骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为1×108 L-1,加入含有20 μg/L肝细胞生长因子培养液培养，定期更换培养液。 主要观察指标：流式细胞仪检测细胞表面标志和碱性磷酸酶染色鉴定细胞类型。倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。培养的1，3，7， 14， 21， 28 d以细胞免疫组织化学检测细胞甲胎蛋白、细胞角蛋白18和清蛋白的表达。 结果：接种后，细胞体积增大，形态多样贴壁细胞分化为体积较大的多角形和部分梭形，胞浆丰富，可见多核，接种早期细胞生长比接种晚期生长较快。分离纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞的表面标志为CD29+，CD44+，CD34-，CD45-和CD90+，细胞的碱性磷酸酶染色阴性，细胞纯度达98%以上。骨髓间充质干细胞的甲胎蛋白细胞免疫组织化学染色培养第7天即出现阳性，第14天清蛋白和细胞角蛋白18免疫组织化学染色阳性。 结论：成年大鼠骨髓间充质干细胞在20 μg/L肝细胞生长因子的诱导下，可分化为肝细胞。     

种子细胞在膀胱重建中的研究进展

膀胱组织工程包括三大要素，即细胞支架、种子细胞和讯息因子，而种子细胞在构建组织工程化器官中有着不可替代的作用，是构建组织器官的基本原材料，选择一种既有良好组织相容性又容易获得的种子细胞成为器官重建工作成败的关键所在。目前常用的种子细胞有膀胱移行上皮细胞、膀胱平滑肌细胞、膀胱移行上皮和平滑肌混合细胞、骨髓间充质干细胞，其中后两种细胞较其他细胞更有优势。种子细胞目前存在的问题：①已分化完全的成熟细胞的来源有限和免疫排斥。②已分化完全的成熟细胞在分化培养过程中只能进行有限的分裂传代，如果达到传代的极限，细胞将衰老并死亡；此外还存在去分化问题。③如何将膀胱移行上皮和平滑肌混合细胞、骨髓间充质干细胞培养成正常膀胱仍需进一步分析。     

骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨内生长以及成骨潜能*

摘要 背景：纳米晶胶原基骨修复材料是根据仿生原理制备的纳米骨框架材料,其微结构和成分两方面都与天然骨有相似性 ,具有良好的生物相容性。 目的：研究兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度,以及构建组织工程骨的可行性。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞,体外培养、纯化,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养,第3,7,20天后激光共聚焦和扫描电镜观察二者复合程度。 结果与结论：骨髓间充质干细胞和纳米晶胶原基骨修复材料复合良好,共聚焦显微镜和环境扫描电镜观察均可见细胞生长;纳米晶胶原基骨修复材料能够作为良好的支架,它能使骨髓间充质干细胞在其内稳定生长。提示骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨修复材料内能很好的生长,并且具有成骨潜能。 关键词：纳米晶胶原基骨修复材料;骨髓间充质干细胞;支架;细胞培养;组织工程骨 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.003     

血管内皮生长因子165基因修饰人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质构建活性组织工程皮肤

背景：利用组织工程原理构建的人工皮肤替代物用于皮肤移植可有效解决供皮不足这一难题，但组织工程皮肤很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效。 目的：以血管内皮生长因子165基因修饰的人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质，拟构建活性组织工程皮肤。 设计、时间和地点：以基因工程为基础的组织构建实验，于2008-03/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。 材料：普通级新西兰大白兔5只用于提取脱细胞真皮基质原料，由南昌大学医学院动物科学部提供，人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的患者，pShuttle-CMV/VEGF165质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠。 方法：无菌条件下切取兔耳全层皮肤，将2 cm×2 cm皮片置于0.25%胰酶-EDTA消化液中去掉表皮，再置入曲拉通X-100溶液使真皮细胞完全脱净，磷酸盐缓冲液反复清洗，即为脱细胞真皮基质，4 ℃保存备用。采用密度梯度离心与贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，取传至第3代细胞，按5×105/孔密度接种，待细胞达80%融合时进行脂质体介导的pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染，接种于制备好的脱细胞真皮基质上体外联合培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质的形态观察，组织工程皮肤结构观察。 结果：体外培养的骨髓间充质干细胞大部分呈梭形，基因转染后细胞形态及活性无明显影响；脱细胞真皮基质呈瓷白色，柔韧有弹性。血管内皮生长因子165基因修饰的骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质共培养2 d后，所构建的组织工程皮肤呈淡红色，质软，接种细胞生长状态正常，苏木精-伊红染色及扫描电镜观察可见在脱细胞真皮基质的间隙中有大量长梭形细胞附着生长。 结论：血管内皮生长因子165基因转染的人骨髓间充质干细胞在兔脱细胞真皮基质中生长良好，可在体外联合构建活性组织工程皮肤。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

纳米晶羟基磷灰石胶原复合骨髓间充质干细胞修复骨缺损

背景：临床上对大范围骨缺损还没有很有效的治疗手段，而纳米晶羟基磷灰石胶原复合材料与天然骨骼的结构类似，具有较好的生物相容性，可能为修复骨缺损提供新的途径。 目的：观察纳米晶羟基磷灰石胶原材料复合骨髓间充质干细胞在修复骨缺损中的作用。 方法：分离培养人骨髓间充质干细胞，与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养；通过大体观察、组织学分析及电镜观察了解成骨情况，进一步临床应用于修复骨缺损。 结果与结论：人骨髓间充质干细胞在体外可以大量扩增，复合细胞的材料植入骨缺损处后，X射线摄片动态观察可见骨缺损处连接良好。说明骨髓间充质干细胞具有成骨细胞作用，纳米晶羟基磷灰石胶原材料是一种很好的构建组织工程骨的支架材料。 关键词：骨髓间充质干细胞；羟基磷灰石；纳米材料；组织工程；骨     

人脐血间充质干细胞与β-磷酸三钙的生物相容性

背景：体内实验显示,β-磷酸三钙多孔陶瓷是较为理想的骨组织工程支架材料,但由于体内植入实验受多种因素的影响,不能很好反映细胞的生长、增殖和表型变化。 目的：观察体外人脐血间充质干细胞与β-磷酸三钙多孔陶瓷的生物相容性。 方法：将培养的第6代人脐血间充质干细胞悬液滴注入β-磷酸三钙内部进行复合,然后将干细胞-支架材料复合物置入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养体系中培养,于培养第4,8,12天电镜下观察人脐血间充质干细胞在材料表面及内部生长情况,采用MTT测试法绘制细胞生长曲线,并进行DNA含量、蛋白质含量测定。 结果与结论：人脐血间充质干细胞与β-磷酸三钙体外复合后能够在β-磷酸三钙支架材料表面及内部的孔隙内贴附,且生长良好,其DNA复制和蛋白合成功能不受β-磷酸三钙的影响。说明人脐血间充质干细胞和β-磷酸三钙支架材料生物相容性良好,二者可作为种子细胞和支架材料用于组织工程化骨与软骨的构建。     

胶原海绵和温敏型Ⅰ型胶原细胞相容性比较★

背景：因心脏结构高度复杂、心肌组织有很高的机械顺应性，心肌组织工程对材料的要求高。以往研究表明Ⅰ型胶原和胶原海绵材料均适宜心肌细胞生长及分化。 目的：拟进一步对比观察胶原海绵和温敏型Ⅰ型胶原与骨髓间充质干细胞的相容性, 为心肌组织工程选择更理想的载体材料。 设计、时间及地点：在解放军第四军医大学西京医院心血管内科实验室2007-03/10完成对比观察设计的实验。 材料：胶原海绵由上海其胜制剂有限公司提供；温敏型Ⅰ型胶原由第四军医大学组织工程中心提供。 方法：将体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞分别复合于胶原海绵和温敏型Ⅰ型胶原材料，共同培养7 d，分别于培养第1，3，5 和7天取材。 主要观察指标：扫描电镜和苏木精-伊红染色观察骨髓间充质干细胞细胞形态及附着情况；MTT检测骨髓间充质干细胞细胞增殖情况。 结果: ①扫描电镜检测显示温敏型Ⅰ型胶原材料中骨髓间充质干细胞细胞黏附优于胶原海绵材料，细胞在Ⅰ型胶原材料中生长连接成片，表面有大量分泌颗粒。②MTT检测表明在培养第1，3，5，7天温敏型Ⅰ型胶原材料中骨髓间充质干细胞细胞活性（吸光度值）及细胞分裂增殖速度均高于胶原海绵材料（P < 0.01）。 结论:温敏型Ⅰ型胶原体外与骨髓间充质干细胞的相容性优于胶原海绵。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性*

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。 目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料与兔骨髓间充质干细胞的生物相容性

背景：清华大学材料科学与工程系冯庆玲教授等采用仿生学原理,制成一种塑形简便并且具有良好骨传导、骨诱导性的纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合骨修复材料。但制备的复合材料是否仍具良好的生物相容性尚不确切。 目的：观察纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料与兔骨髓间充质干细胞的相容性。 设计、时间及地点：体外观察实验,于2008-08/11在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。 材料：纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料由清华大学材料系研制,孔隙率90%,孔径50~200 μm。骨髓间充质干细胞由2周龄健康新西兰大白兔股骨和胫骨骨髓经密度梯度离心法获得。 方法：将预湿后的纳米羟基磷灰石/壳聚糖材料置于培养板内,将第3代骨髓间充质干细胞接种于材料表面在体外复合培养。对照组为单纯骨髓间充质干细胞培养。 主要观察指标：倒置显微镜、扫描电镜观察细胞和材料复合培养后细胞生长状况,计数细胞接种后1,2,4 h在材料表面的黏附状况,CCK-8检测细胞在复合材料上的增殖状况,流式细胞仪检测种植细胞的细胞周期。 结果：骨髓间充质干细胞在复合材料表面上生长状况良好。细胞接种到复合材料1 h时黏附率低于对照组（P < 0.05）,但接种2,4 h后两组黏附率差异无显著性意义（P > 0.05）。细胞接种后,两组均保持正常的分裂增殖速度(P > 0.05) 。材料组和对照组细胞皆为正常的二倍体细胞,未见异倍体细胞形成,复合材料对兔骨髓间充质细胞的细胞周期影响不大。 结论：纳米羟基磷灰石/壳聚糖与骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性。     

黄芪诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景：课题组以往的研究证实黄芪对体外培养的人表皮体外扩展生长和表皮干细胞增殖均具有促进作用，但它对人骨髓间充质干细胞的体外作用如何特别是是否具有诱导骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的效应，仍不清楚。 目的：观察黄芪体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察，于2006-09/2008-06在南昌大学第一附属医院完成。 材料：骨髓来源于临床骨髓穿刺检查正常患者，无血液系统疾病和家族遗传病史。 方法：用密度梯度离心结合贴壁法分离纯化培养人骨髓间充质干细胞，以含黄芪、胎牛血清、角质细胞无血清培养基组成的诱导培养液进行体外培养，以不含黄芪的上述培养液作为对照。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞形态学变化，免疫细胞化学染色法检测p63和广谱细胞角蛋白的表达。 结果：经黄芪诱导后部分细胞由长梭形转变为扁园形，呈表皮样细胞形态特征；免疫细胞化学染色显示部分诱导细胞p63、广谱细胞角蛋白表达均呈阳性。 结论：黄芪可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。