志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立

目的 建立快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR方法.方法 根据志贺菌ipaH基因、沙门菌ipaB基因及霍乱弧菌EPSM基因设计特异性PCR引物,加热煮沸法制备DNA模板,进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测.结果 应用所建立的多重PCR方法能分别或同时快速、特异地检测出志贺菌606bp、沙门菌314bp和霍乱弧菌482bp的目的基因.结论 初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系,可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断.     

基于颜色判定的DNA环介导恒温扩增法快速检测金黄色葡萄球菌

目的建立基于颜色判定的DNA环介导恒温核酸扩增法（100p—mediatedisothermalamplificationofDNA,LAMP）快速检测金黄色葡萄球菌（SAU）技术。方法利用LAMP法针对SAU特异基因rtUC基因设计7套引物,通过对7套引物扩增效率进行比较得到最佳引物组合来快速检测SAU,采用两种结果判断方法在50min内完成反应。结果LAMP方法检测核酸的最低浓度为7．16pg／μl,灵敏度为PCR法的10倍（PCR法为71．6pg／μ1）,同时采用22种同源或相似菌种进行特异性检测,结果表明具有良好的特异性。结论LAMP方法检测过程简单,实验装置简便,反应结果肉眼可视化辨别,灵敏度高,特异性强,特别适合基层防疫与检疫部门对SAU的快速检测。     

环介导恒温扩增法对嗜麦芽寡养单胞菌L2型头孢菌素β内酰胺酶基因的快速检测

目的建立快速检测L2型头孢菌素β内酰胺酶的方法。方法利用DNA环介导恒温核酸扩增法（loopmediated isothermal amplificationofDNA,LAMP）针对L2型头孢菌素B内酰胺酶基因设计的5条特异性引物,通过引物特异性识别特定BlaL2基因上的7个独立区域实现耐碳青霉烯类嗜麦芽寡养单胞菌的检测。实时浊度仪监测反应结果表明,LAMP反应在65℃恒温条件下50min内完成;钙黄绿素可视化检测表明阳性结果呈绿色,与阴性结果差异显著。结果LAMP法最低检出基因的浓度为2．58pg／μl,其灵敏度为PCR法的100倍,且具有良好的特异性。结论LAMP法具有过程简单、实验装置简便、结果肉眼可辨别、灵敏度高、特异性强等特点,对非12型头孢菌素B内酰胺酶基因的结果呈阴性,适用于临床L2型头孢菌素β内酰胺酶基因的快速检测。     

基于颜色判定的环介导恒温扩增法快速检测结核分枝杆菌

目的建立快速检测结核分枝杆菌环介导的恒温扩增法。方法针对结核分枝杆菌特异性保守靶序列IS6110,采用环介导的恒温扩增法（LAMP）引物设计原则设计6条引物,特异性识别靶基因序列上8个独立区域。LAMP反应过程中会产生焦磷酸镁白色沉淀,可以通过实时监测反应液浊度来判断反应结果。结果试验表明,在60～65℃恒温条件下,LAMP反应60 min内即可完成;如果在反应前添加钙黄绿素,可通过反应液颜色的变化来判断反应结果;LAMP方法的最低检出核酸浓度为101 pg/μl,其灵敏度是PCR方法最低检出浓度1.01 ng/μl的10倍,且具有良好的特异性。结论 LAMP方法检测结核分枝杆菌具有简单、快速、价廉、特异性强、灵敏度高等特点,适用于疾控工作及临床筛查或快速检测结核杆菌。     

通过环介导恒温扩增技术检测空肠弯曲杆菌

目的 建立基于DNA环介导恒温核酸扩增法(LAMP)快速检测空肠弯曲杆菌.方法 以空肠弯曲杆菌马尿酸酶基因(hipO基因)为靶序列,设计6套特异性引物进行LAMP反应,通过比较扩增效率筛选出最佳引物用以快速检测空肠弯曲杆菌.对检测方法的特异性进行验证,敏感性与PCR法比较.结果 实时浊度仪监测反应结果表明,LAMP反应在62℃恒温条件60 min 内完成;如果在反应前添加钙黄绿素与氯化锰混合液(FD),黄绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果.LAMP法最低检出限为6.97×102拷贝/μl,敏感性为PCR法(6.97×103拷贝/μl)的10倍.结论 LAMP法用于快速检测空肠弯曲杆菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果判读方便、敏感性高、特异性强等特点,特别适于现场和基层检疫及医疗机构快速诊断.     

一步法快速鉴定皮肤癣菌

目的探讨一步法快速鉴定皮肤癣菌的临床价值。方法采用快速简便的一步法处理癣菌及非癣菌菌株获得菌株DNA。癣菌通用引物的敏感性测定:将获得的菌株DNA以及人DNA进行PCR扩增后跑电泳,观察是否出现特定大小的阳性条带。PCR反应体系的敏感性测定:用超微量分光光度计测量癣菌菌液的DNA浓度,再将癣菌菌液的DNA进行10倍连续稀释,获得不同浓度的癣菌菌液,随后进行PCR扩增,记录特定大小的阳性条带出现时的最小癣菌DNA浓度值,PCR重复做3次。结果所有癣菌菌株经PCR扩增后均出现366 bp的阳性条带,非癣菌菌株及人DNA经PCR扩增后均未出现任何条带。将浓度为600 ng/μl的癣菌DNA浓度经10倍连续稀释后,得到的7个浓度菌液,其中600 ng~6 pg经PCR扩增后出现366 bp的阳性条带,第7个600 fg浓度经PCR扩增后未出现任何条带。结论皮肤癣菌通用引物CHS1具有较高的特异性,可用作检测癣菌的特异性引物,本实验PCR体系的敏感度较高,为6 pg。     

耐万古霉素肠球菌检测基因芯片方法的建立和验证

目的：基于基因芯片技术建立一种能快速甄别粪肠球菌、屎肠球菌及万古霉素耐药基因的检测方法。方法根据GenBank中查找的2种常见肠球菌特异性基因序列（ ddl）及万古霉素耐药基因（ vanA,vanB）序列,设计与合成用于检测肠球菌的特异性基因及耐药基因的引物和探针,制备耐万古霉素肠球菌（VRE）检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的特异性基因与耐药基因片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光法显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光法检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏性和重复性。结果共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条细菌通用探针、4条特异性检测探针。该芯片具有良好的特异性和重复性,灵敏性可达103 CFU／ml。10例临床分离株样本的芯片检测结果与药敏实验基本一致（8／10）。结论初步建立了检测VRE的基因芯片方法,利用此方法可以甄别2种VRE种类并检测其耐药基因。     

LAMP和荧光定量PCR检测食品中致病微生物的比较研究

目的比较环介导等温扩增(LAMP)和荧光定量PCR技术对沙门菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的检测效果。方法对2株沙门菌、2株大肠埃希菌和3株金黄色葡萄球菌分别采用LAMP及荧光定量PCR进行检测,比较两种方法的检测结果。结果两种方法均展示很好的检测效果,在对牛奶和污水的检测中,两者的检测率相同,在对虾的检测中,荧光定量PCR相对于LAMP表现更高检测率,对沙门菌和大肠埃希菌的检测率,两法差异均无统计学意义(P>0.05),对金黄色葡萄球菌的检测率,两法差异有统计学意义(P<0.05)。结论荧光定量PCR和LAMP对食品致病菌的检测都具有较高的敏感度。     

基因芯片技术直接检测常见腹泻病致病菌的应用研究

目的 探讨基因芯片技术在腹泻病粪便标本常见致病菌检测中的应用.方法 筛选7种常见腹泻病致病菌的特异基因作为检测目的 基因,分别为志贺菌ipaH基因、沙门菌hilA基因、副溶血弧菌tdh基因、空肠弯曲菌FlaA基因、肠出血性大肠埃希菌stxA2基因、肠产毒性大肠埃希菌st基因、霍乱弧菌ctxA2基因.设计相应的引物及探针,制备寡核苷酸芯片.对多重PCR扩增条件进行优化,将PCR扩增产物与带有7种特异探针的基因芯片杂交.检测标准菌株25株,模拟粪标本及临床腹泻病粪便标本64份.结果 经优化多重PCR扩增出7种腹泻病致病菌特异的致病基因片段,与基因芯片特异的探针杂交后.全部产生特异性杂交信号.标准菌株及模拟粪标本检测的阳性和阴性对照符合率均为100%.单一菌株最低检测量为10～100cfu/ml.64份腹泻病粪便标本检测出45份致病菌,其中33份志贺菌、12份副溶血弧菌,检出率为70.3%(45/64).粪培养检出 16份志贺菌,6份副溶血弧菌.检出率为34.4%(22/64),基因芯片法明显优于粪培养方法(P<0.01).结论 该基因芯片直接检测腹泻病致病菌,检出率高,达到了高效的检测目的 ,具有较好的实用性.     

副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种快速检测副溶血弧菌的实时荧光定量PCR方法.方法 根据副溶血弧菌tdh基因设计合成引物及TaqMan探针,利用阳性质粒和模拟标本建立副溶血弧菌实时荧光定量PCR检测方法.结果 以副溶血弧菌DNA为模板克隆了tdh基因,得到阳性质粒.利用阳性质粒建立了定量PCR方法,得到标准曲线y=-4.9197x+58.72,决定系数(R2)为0.9864.此方法具有很好的特异性,在对15种肠道致病菌的检测中,只有副溶血弧菌基因组DNA的扩增结果为阳性.对粪便和食物模拟标本进行检测,敏感性均为102cfu/μl.此方法重复性较好,对4种浓度(105、104、103、102cfu/μl)的菌液各进行3次检测,结果均为阳性,且Ct值的变异系数＜2%.结论 建立了一种检测副溶血弧菌的荧光定量PCR方法,该法的敏感性和特异均较好,适用于快速、准确地检测食品和粪便中的沙门菌.     

Rapid sperm lysis and novel screening approach for human male DNA via colorimetric loop-mediated isothermal amplification

Correct identification of probative samples is the first crucial step in the analysis of sexual assault kits (SAKs). We report a nucleic acid-based approach, as an alternative to the widely utilized p30 assay, to screening male DNA from SAKs collected from female victims by combining a rapid lysis protocol with an isothermal amplification method. The enzymatic lysis protocol efficiently digests biological material to release nuclear DNA in 10 min in a single closed tube, including resilient cell types such as sperm cells. The amplification and detection of human male specific DNA is achieved through loop-mediated isothermal amplification (LAMP) accompanied with hydroxynaphthol blue, a colorimetric indicator, producing a visually-distinctive color change in the presence of male DNA. The Y-screen approach demonstrated high specificity to human male DNA, can reliably detect target DNA as low as 50 pg, and correctly identified all probative samples from 14 single-blind mock sexual assault samples. In contrast with the widely used p30 assay which requires at least 2 h incubation time and manual application to a lateral flow pad, this Y-screen assay can be completed in half the time, and can be performed in a 96-well format without the need for a fluorescence detector, making facile high-throughput sample screening possible.     

BioSunLAMP:一个用于环介导等温扩增的引物设计软件

目的环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型等温核酸扩增方法。由于其具有简便、高效、特异性高和成本低等优点,在甲型H1N1流感和肺结核等流行病检测中得到了广泛应用。在LAMP技术中,关键的起始步骤是设计合适的引物序列。为了让引物设计更加方便与高效,我们开发了LAMP引物设计软件BioSunLAMP。方法采用Delphi程序设计语言开发了界面友好、便于使用的软件系统。结果经甲型H1N1流感、结核分枝杆菌实验验证,BioSunLAMP软件设计的引物达到了预期效果。此外,与同类软件相比,BioSunLAMP还具有如下特点:①集引物设计与引物特异性分析于一体,可以通过本地数据库或远程调用NCBI的相关数据库来检查引物特异性;②支持针对多序列的通用引物与特异引物设计。结论 BioSunLAMP软件的开发,为LAMP技术的普及提供了很好的生物信息学支持。     

A proof-of-principle study on implementing polymerase chain displacement reaction (PCDR) to improve forensic low-template DNA analysis

Polymerase chain reaction (PCR) plays an important role in forensic DNA analysis. However, the amplification of low-template DNA (LTDNA) samples usually encounters unsatisfactory results for the limited efficiency of PCR, which would interfere with the subsequent profile interpretation. Polymerase chain displacement reaction (PCDR) is a highly-efficient technique characterized by combining PCR and strand displacement reaction into a single PCDR cycle. This study explored the feasibility of PCDR for improving forensic LTDNA analysis. STR markers commonly used in forensic genetics were subjected to PCDR amplification and capillary electrophoresis detection. The results of singleplex reactions indicated that PCDR surpassed original PCR in efficiency for STR amplification. The average peak height of alleles in PCDR profiles was linearly correlated to the number of outer primers adopted for initiating the strand displacement process. Further, we assessed the multiplexing potential of PCDR by incorporating 17 STRs included in the expanded CODIS core loci and Amelogenin gene into a multiplex PCDR system. For pristine DNA templates ranged from 200 pg to 12.5 pg, the multiplex PCDR system consistently exhibited higher allele peak height as well as less allele dropout compared to the multiplex PCR references. Meanwhile, a significant reduction of stutter ratio was extensively observed in PCDR profiles. We also tested mock casework samples to verify the practical ability of multiplex PCDR for LTDNA detection. With DNA input varying from 48.1 pg to 6.6 pg, the multiplex PCDR system consistently obtained more allelic information than multiplex PCR methods. Our data collectively suggested that it is feasible to apply PCDR in forensic LTDNA analysis.     

Low-volume amplification on chemically structured chips using the PowerPlex16 DNA amplification kit

In forensic DNA analysis, improvement of DNA typing technologies has always been an issue. It has been shown that DNA amplification in low volumes is a suitable way to enhance the sensitivity and efficiency of amplification. In this study, DNA amplification was performed on a flat, chemically structured glass slide in 1-μl reaction volumes from cell line DNA contents between 1,000 and 4 pg. On-chip DNA amplification reproducibly yielded full allelic profiles from as little as 32 pg of template DNA. Applicability on the simultaneous amplification of 15 short tandem repeats and of a segment of the Amelogenin gene, which are routinely used in forensic DNA analysis, is shown. The results are compared to conventional in-tube amplification carried out in 25-μl reaction volumes. U. Schmidt and S. Lutz-Bonengel contributed equally to this work.     

多种食源性致病菌的基因芯片检测技术

目的探讨随机PCR结合基因芯片技术用于多种食源性致病菌筛查检测的可行性。方法利用Clustal X和Oligo 6.0软件设计探针,进行生物信息学比对验证特异性,探针末端修饰后合成并制备基因芯片。使用锚定随机引物扩增细菌基因组DNA,偶联荧光染料的扩增产物与芯片杂交后扫描检测。对随机PCR及杂交反应等一系列检测条件进行优化。选取16种病原细菌进行芯片特异性验证,使用4种食源性致病菌DNA进行芯片灵敏度检测及重复性评价,制备细菌DNA混合样本和痢疾志贺菌模拟水污染样本对芯片检测效能进行初步考核。结果 9种食源性致病菌获得阳性结果,基因组DNA检测灵敏度102～103pg/μl,芯片重复性变异系数(CV)值<15%,混合样本检测与预期结果一致,最低可检测水样本中痢疾志贺菌的最低浓度为3.54×105cfu/ml。结论初步建立的基于随机引物PCR的基因芯片技术进行多种食源性致病菌检测的方法,为病原细菌高通量筛查检测提供了一种新的思路。