血管内皮细胞生长因子基因转染皮肤成纤维细胞的实验研究

为改善人工复合皮在临床上的应用效果 ,构建人血管内皮细胞生长因子 16 5 (hVEGF165)基因重组载体pcDNA3,并转染成纤维细胞。检测转基因细胞培养上清液VEGF浓度 ;用转基因细胞培养上清液刺激人脐静脉血管内皮细胞 ,观察内皮细胞增殖速度 ;通过Miles实验检测VEGF的生物学活性。结果显示 ,转基因成纤维细胞能够表达一定浓度的VEGF,且具有加速体外培养人脐静脉血管内皮细胞 (HUVEC)生长和增强血管通透性的生物学活性。提示转hVEGF165基因成纤维细胞可修饰人工皮的真皮面。     

aFGF重组腺病毒体外诱导血管新生的实验研究

促血管生长因子可以刺激内皮细胞分裂、分化，诱导血管新生。为探讨其基因转染是否具有相同的作用，作者用构建好的携带人酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）DNA的重组腺病毒载体（Ad.aFGF）转染人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。免疫荧光染色表明，转染了Ad.aFGF的HUVECs有明显的aFGF表达；ELISA检测显示aFGF能分泌至细胞外；MTT实验显示Ad.aFGF转染后HUVECs显著增生，并且当它们种植于Matrigel基质时可分化形成毛细血管样结构，对照组则无此现象。这些结果说明Ad.aFGF在体外具有促进血管新生的作用，这为其应用于体内刺激侧支血管的生长提供了实验依据。     

血管内皮细胞生长因子基因转染促进股骨头软骨下坏死区修复的实验研究

目的观察血管内皮细胞生长因子（vascular endothelim growth factor，VEGF）促进兔股骨头软骨下坏死区血管重建及骨修复的作用。方法采用液氮冷冻造成兔股骨头坏死，腺病毒介导的人血管内皮细胞生长因子基因转染坏死股骨头，组织学技术观察软骨下骨修复的情况，骨矿分析仪测定股骨头骨密度（BMD），图像分析技术测量骨小梁的形态学指标。结果目的基因转染组软骨下血管生成速度、成骨速度、成骨质量和数量及矿化程度显著高于空病毒对照组和空白对照组，软骨下骨吸收明显少于两个对照组。结论血管内皮细胞生长因子可能具有促进股骨头软骨下坏死区再血管化及骨修复，间接保护坏死骨小梁不被吸收，避免软骨下力学性能下降的作用。     

腺病毒介导的P21WAF1/CIP1基因诱导血管平滑肌细胞凋亡

目的：应用重组腺病毒载体介导的P21^WAF1/CIP1基因转染血管平滑肌细胞（VSMC），探讨P21^WAF1/CIP1基因对平滑肌细胞凋亡的诱导作用。材料与方法：P21^WAF1/CIP1的重组病毒载体转染体外培养的猪主动脉平滑肌细胞，应用RT－PCR检测外源性P21^WAF1/CIP1基因的表达，并通过细胞形态、原位细胞凋亡分析、流式细胞仪和细胞生长曲线等方法观察P21诱导VSMC凋亡，抑制VSMC增殖的情况。结果：P21^WAF1/CIP1基因的重组腺病毒载体可以有效地转入平滑肌细胞中，诱导平滑肌细胞凋亡，并能显著地抑制平滑肌细胞增殖。结论：外源性P21^WAF1/CIP1基因转移可以诱导平滑肌细胞凋亡，显著地抑制平滑肌细胞增殖。     

重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况. 方法 将PCR获取的VEGF165目的 基因插入到pAATrackCMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经Pme I酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落.提取质粒并用Pac I酶切鉴定.线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒.并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度.体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察.转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VFGF165的表达水平. 结果 经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒.Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达.ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P＜0.01). 结论 pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VFGF165为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础.     

RNA干扰抑制胆囊癌血管内皮细胞生长因子的实验研究

目的：构建编码胆囊癌VEGF基因的短发夹状RNA（shRNA）,观察shRNA干扰对胆囊癌血管内皮细胞表达的影响。方法：根据人VEGF基因的序列选择了4个位点设计shRNA,制备VEGF-shRNA质粒表达载体,并进行测序分析。将重组质粒转染到胆囊癌细胞GBC-SD中,采用荧光PCR检测VEGF-mRNA表达情况,ELISA法及Western-blot法检测VEGF蛋白含量。结果：成功构建了靶向VEGF基因的shRNA质粒表达载体,并经测序验证。实时荧光PC分析shRNA2抑制VEGF基因的mRNA表达,抑制率可达86%.由ELISA法及Western-blot法看出ShVEGF-1、ShVEGF-2、ShVEGF-3、ShVEGF-4中VEGF的表达得到明显的抑制,且Sh-VEGF-4效果最显著（P〈0.05）,而NC细胞（阴性对照）则基本没有抑制VEGF的表达（P〉0.05）。结论：成功构建靶向VEGF的shRNA表达质粒,其对胆囊癌血管内皮细胞表达具有明显抑制作用。     

腺病毒介导的hVEGF基因转染细胞修复大鼠放射性皮肤溃疡的效果研究

目的 评价转染人血管内皮生长因子165(hVEGF 165)重组腺病毒载体的成纤维细胞体外表达状态及转染细胞修复放射性皮肤溃疡的效果。方法 构建hVEGF165基因过表达重组腺病毒载体,转染大鼠原代成纤维细胞,通过荧光定量PCR、免疫细胞化学和Western blot观察hVEGF165体外过表达状态;清洁级SD雄性大鼠24只,50 Gy γ射线局部照射,照后7 d于受照局部注射转染hVEGF165细胞,通过荧光定量PCR,分析转染基因在注射部位的表达状况,外观观察和组织学观察动物体内转基因细胞对放射性皮肤溃疡愈合效果的影响。结果 hVEGF转染组细胞体外实验中hVEGFmRNA表达显著上调,约为空转染组的88 373倍,胞质中出现hVEGF蛋白强阳性表达,且于相对分子质量23 000附近出现VEGF蛋白的特异性条带;受照后约2周局部出现溃疡,hVEGF转染组平均溃疡面积为40.2 mm²,比空转染对照组减少57%,愈合时间缩短约6 d,处理后3 d、1周皮肤组织中hVEGF mRNA相对表达量分别为空转染组的5.15和4.15倍(t=3.385、3.220,P<0.05)。结论 转染hVEGF165重组腺病毒载体的大鼠成纤维细胞能够在体外过量表达VEGF,且该转染细胞注射体内能够缩短放射性皮肤溃疡的愈合时间,增强损伤的愈合效果。     

重组腺病毒Ad-huVEGF121治疗兔股骨头坏死的实验研究

目的探讨一种治疗股骨头缺血坏死的新方法.方法重组腺病毒Ad-huVEGF121注射入坏死的股骨头,应用RT-PCR和免疫组织化学技术检测VEGF121的表达,用组织形态学技术观察坏死股骨头的修复过程.结果转染后的股骨头内有VEGF121表达,组织形态学观察发现转染后血管生成明显增多,新骨形成明显多于对照组.结论转染VEGF121基因可以增加骨组织内血管生成,坏死骨的修复速度增快.     

BTEB2反义基因转染对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的：研究BTEB2反义基因转染对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响。方法：将BTEB2 cDNA反向克隆至腺病毒载体,构建携带反义BTEB2基因的重组腺病毒Ad-ASBTEB2;用Ad-ASBTEB2转染VSMC,经免疫印迹法检测BTEB2蛋白质表达;通过改良Boyden趋化小室检测VSMC迁移数;用免疫细胞化学技术检测促VSMC迁移血小板源性生长因子B链（PDGF）的表达。结果：（1）Ad-ASBTEB2转染明显抑制VSMC的BTEB2蛋白表达;（2）Ad-ASBTEB2组VSMC迁移数较未转染组（P〈0．01）和Ad．LacZ组（P〈0．01）显著减少;（3）Ad-ASBTEB2组PDGF-BB表达较Ad．LacZ组和未转染组显著降低。结论：BTEB2反义基因转染显著抑制AngⅡ诱导的VSMC的迁移,这种抑制作用可能是通过减少促迁移因子的表达而实现的。     

重组人血管能抑制素分泌型表达载体的构建及其生物学效应研究

目的　构建表达分泌型人血管能抑制素 (canstatin)蛋白的真核表达载体 ,观察其生物学效应。方法　以SOEPCR法将canstatin及癌胚抗原 (CEA)引导肽cDNA体外连接 ,并定向克隆到真核蛋白表达载体pCMV Script上 ,脂质体介导转染HUVEC及A5 4 9细胞 ,荧光定量PCR法检测转染细胞canstatin基因表达量 ,并采用多种方法检测该重组载体的生物学活性。结果　成功构建canstatin分泌型载体 ,在其转染的肿瘤细胞和人脐静脉内皮细胞中均检测到不同拷贝数的表达。转染后HUVEC生长增殖缓慢 ,出现G0 ～G1期阻滞并伴有大量凋亡 ,与空载体转染组相比差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ;而A5 4 9细胞转染后与空载体转染组在以上几个方面差异均无统计学意义 (P >0 0 5 )。重组载体转染A5 4 9细胞上清液干预的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成明显减少 ,且颜色苍白、轮廓模糊 ,空载体转染组和未干预组血管生长旺盛、脉络清晰。结论　SOE法构建的含有CEA引导肽的canstatin分泌型表达载体能在转染的内皮细胞及肺癌细胞中稳定表达 ,可有效抑制内皮细胞生长增殖并诱导凋亡。重组载体转染的细胞可分泌有生物学活性的canstatin。     

Coexpression of herpesviral thymidine kinase reporter gene and VEGF gene for noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer: an in vitro evaluation.

Coexpression of a reporter gene and a therapeutic gene may allow for noninvasive monitoring of cardiac gene therapy. We sought to evaluate the usefulness of an adenoviral vector expressing mutant herpesviral thymidine kinase reporter gene (HSV1-sr39tk) and vascular endothelial growth factor (VEGF) 121 in independent expression cassettes (Ad4tk). METHODS: Accumulation of 14C-2'-fluoro-5-methyl-1-beta-D-arabinofuranosyluracil (FIAU) and 9-(4-18F-fluoro-3-hydroxymethylbutyl)guanine (FHBG) as reporter probes, and secretion of VEGF into medium, were determined for Ad4tk-infected H9c2 rat cardiac cells in vitro. RESULTS: In vitro tracer uptake increased with increasing vector concentration and over time. It was comparable to cells infected with adenovirus expressing only wild-type HSV1-tk (reporter probe: 14C-FIAU) or mutant HSV1-sr39tk (reporter probe: 18F-FHBG). No significant uptake was observed in cells infected with adenovirus expressing VEGF alone. With increasing vector concentration, Ad4tk-infected cells increasingly released VEGF into medium. VEGF production correlated significantly with cellular reporter probe uptake (r = 0.93; P = 0.0003). CONCLUSION: The usefulness of a vector coexpressing HSV1-tk and VEGF for noninvasive imaging of expression of a therapeutic transgene has been demonstrated in vitro. This approach may allow for future in vivo monitoring of cardiac angiogenesis gene therapy.     

^99Tc^m-亚锡葡庚糖酸钠结合GGC序列监测基因治疗的实验研究

目的 构建以金属结合肽（双甘氨酰半胱氨酸,即GGC序列）为核素报告基因、人VEGF165为治疗基因的重组腺病毒载体,以99Tcm-GH为报告探针,探讨该报告系统监测治疗基因表达的可行性.方法 pcDNA3-VEGF165质粒线性化后,将金属结合肽GGC序列连于VEGF165基因C端,通过内部核糖体切入位点（IRES）连接增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,构建重组腺病毒载体Ad5-VEGF165GGCmotif-IRES-EGFP（Ad5-VIE）,同时构建腺病毒包装EGFP（Ad5-EGFP）为对照.以不同感染复数（MOI=0,10,25,50,100）Ad5-VIE感染大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）后,用99Tcm-GH为报告探针,研究感染细胞摄取动力学（30,60,90和120 min）情况,以检测GGC序列在MSC中的表达,并与实时定量PCR、Western-blot蛋白印迹、免疫组织化学等方法鉴定的VEGF165表达进行对比分析.通过荧光显微镜及实时定量PCR检测EGFP在细胞中的表达.采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,组间比较运用独立样本成组t检验、q检验和直线（Pearson）相关分析.结果 以Ad5-VIE感染MSC后,不同MOI摄取实验结果示细胞对99Tcm-GH的摄取率随病毒MOI的增加而逐渐增加（r2=0.86,P＜0.05）,并且在MOI=100时达到（7.94±0.75）%;不同时间摄取实验示随99Tcm-GH孵育时间延长,细胞摄取率逐步增高,至120 min时达到（7.72±0.22）%.Ad5-VIE感染组与Ad5-EGFP感染组摄取率在各个不同时间点差异均有统计学意义（t=15.10～54.92,P均＜0.05）.在mRNA水平上,VEGF165及EGFP表达均随病毒MOI增加而增加（r2=0.99,P＜0.05）.不同MOI下细胞对99Tcm-GH的摄取与VEGF165蛋白表达呈较好的相关性（r2=0.90,P＜0.05）.免疫组织化学检查结果表明人VEGF165目的 基因在MSC中成功表达.荧光显微镜下可以观测到被感染细胞中的EGFP蛋白.结论 成功构建的重组腺病毒系统Ad5-VIE感染MSC对99Tcm-GH的摄取与VEGF165表达呈正相关.以GGC多肽为报告基因可以监测治疗基因VEGF165的表达,为核素报告基因显像提供了理论依据.     

EGFP标记的VEGF165重组质粒的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建pIRES2-EGFP-VEGF165真核表达质粒,并在大鼠骨髓间充质干细胞内表达。方法应用DNA重组方法构建pIRES2-EGFP-VEGF165,并将其转染到大鼠骨髓间充质干细胞内,采用ELISA和MTT法检测转染后细胞培养上清液中VHGF165的含量及生物活性。结果成功构建了pIRES2-EGFP-VHGF165,将其转染骨髓间充质干细胞后,VEGF蛋白表达水平明显增高．转染后的细胞培养上清具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论成功构建了真核表达质粒pIRES2-EGFP-VEGFl65．将其转染骨髓间充质干细胞后可高水平地表达具有生物学活性的VEGF蛋白。     

重组腺病毒Ad5-KAI1对骨髓瘤细胞的功能调节作用

目的研究抗癌一号KAI1（又称CD82）基因对骨髓瘤细胞生物学特性的影响及机制。方法将携带KAI1基因克隆至重组腺病毒,制备Ad5-KAI1重组腺病毒,并感染骨髓瘤细胞SKO-007。Ad5-GFP作为阴性对照,未感染细胞为空白对照,利用CCK-8和AnnexinⅤ-PI等方法分别检测不同时间点（24 h,48 h）的细胞活率和凋亡水平。另外,利用W estern印迹方法检测不同组别细胞表达ERK及其磷酸化水平。结果 Ad5-KAI1组细胞活率抑制水平和凋亡水平明显高于对照组,且剪切型胱天蛋白酶（caspase）3、ERK磷酸化水平在实验组高表达,而抑制ERK磷酸化则导致凋亡进一步增加。结论 KAI1显著抑制骨髓瘤细胞增殖,并诱导其caspase依赖的凋亡;KAI1在促进凋亡的同时,其应激性诱导了ERK磷酸化,后者又对细胞具有保护作用。     

肺癌血管内皮生长因子的表达及其意义

采用ＳＰ免疫组织化学方法观察血管内皮生长因子在９４例肺癌组织的表达。结果显示，ＶＥＧＦ在肺癌组织表达的阳性率为７０．２％，明显高于癌旁正常组织。     

腺病毒表达Ribozyme在细胞内对HBV的免疫作用

了解利用腺病毒腺体表达针对乙型肝炎病毒（HBV）的核酶在细胞内对HBV表达的抑制作用。将针对HBV的多位点核酶克隆入腺病毒载体中，利用包装细胞包装出含核酶及突变核酶的重组腺病毒，将腺病毒感染2．2．15细胞（含HBV），检测感染细胞中核酶及突变核酶的表达，利用ELISA，打点杂交及激光共聚光共聚焦等方法，检测核酶对细胞内乙型肝炎病毒表达的抑制作用。结果显示核酶及突变核酶的确被克隆入腺病毒载体，并经过包装后可形成包装腺病毒，感染2．2．15细胞后可表达出目的核酶，并发挥核酶的剪切作用，其对HBV表达的抑制率最高可达87．1％。证实包装腺病毒表达的多位点核酶对HBV的复制有明确的抑制作用，支持核酶的抗病毒效果，有希望成为HBV治疗的潜在方法之一。     

急性髓系白血病患者血浆中血管内皮生长因子水平及其临床意义

为探讨血管内皮生长因子 (VEGF)在成人急性髓系白血病 (AML)发生发展中的作用 ,采用ELISA方法研究AML病人血浆中VEGF的表达。结果难治性和非难治性AML病人血浆中VEGF浓度分别为 5 5 8.90pg/ml和 392 .5 4 pg/ml,均高于正常人 (5 7 2 7pg/ml)和AML骨髓移植后病人(77 31pg/ml) ,除正常人与AML骨髓移植后病人比较无统计学差异外 ,其他两者之间比较均有显著性差异 (P <0 0 5 )。 18例持续完全缓解中位时间 6个月的AML病人血浆VEGF浓度 (196 14pg/ml)低于非难治性、难治性AML(P值均 <0 0 1) ,而高于AML骨髓移植后病人及正常人血浆中VEGF浓度 (P值均 <0 0 5 )。提示AML病人血浆VEGF水平明显增高 ,在AML的发病机制中可能起一定的作用 ,且可能成为判断AML病人预后的指标之一。     

Ad－HGF基因修饰的胎盘间充质干细胞治疗兔肢体缺血的实验研究

目的：研究重组腺病毒介导肝细胞生长因子（ adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor,Ad－HGF）修饰的胎盘源间充质干细胞（ placenta－derived mesenchymal stem cells,PMSC）在兔肢体缺血模型中促新生血管生成的作用。方法无菌取足月产妇胎盘胎儿面中心区域胎盘组织,胶原酶消化法分离干细胞,体外培养传代,感染Ad－HGF 48 h后收集细胞用于治疗兔肢体缺血实验。左侧治疗组后肢缺血肌肉组织内多点注射总细胞数5×106／ml Ad－HGF修饰的PMSC,右侧对照组后肢缺血肌肉组织内注射生理盐水。结果治疗后第14天腹主动脉穿刺行数字减影血管造影（ digital subtraction angiography,DSA）检查,可见左侧肢体缺血治疗后微血管生成数明显多于未治疗右侧肢体,血管形成能力明显增强。苏木精伊红染色法（ HE）后置光镜下观察显示,治疗组毛细血管密度明显大于未治疗组（P＜0．05）。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测后肢肌肉组织中血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor, VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（ basic fibroblast growth factor,bFGF）、HGF的表达明显升高（P＜0．05）。结论经Ad－HGF基因修饰的PMSC能明显促进血管新生,加快局部缺血组织血流循环的重建,是治疗肢体慢性缺血的有效手段。