腺病毒介导的hVEGF基因转染细胞修复大鼠放射性皮肤溃疡的效果研究

目的 评价转染人血管内皮生长因子165(hVEGF 165)重组腺病毒载体的成纤维细胞体外表达状态及转染细胞修复放射性皮肤溃疡的效果。方法 构建hVEGF165基因过表达重组腺病毒载体,转染大鼠原代成纤维细胞,通过荧光定量PCR、免疫细胞化学和Western blot观察hVEGF165体外过表达状态;清洁级SD雄性大鼠24只,50 Gy γ射线局部照射,照后7 d于受照局部注射转染hVEGF165细胞,通过荧光定量PCR,分析转染基因在注射部位的表达状况,外观观察和组织学观察动物体内转基因细胞对放射性皮肤溃疡愈合效果的影响。结果 hVEGF转染组细胞体外实验中hVEGFmRNA表达显著上调,约为空转染组的88 373倍,胞质中出现hVEGF蛋白强阳性表达,且于相对分子质量23 000附近出现VEGF蛋白的特异性条带;受照后约2周局部出现溃疡,hVEGF转染组平均溃疡面积为40.2 mm²,比空转染对照组减少57%,愈合时间缩短约6 d,处理后3 d、1周皮肤组织中hVEGF mRNA相对表达量分别为空转染组的5.15和4.15倍(t=3.385、3.220,P<0.05)。结论 转染hVEGF165重组腺病毒载体的大鼠成纤维细胞能够在体外过量表达VEGF,且该转染细胞注射体内能够缩短放射性皮肤溃疡的愈合时间,增强损伤的愈合效果。     

缺氧条件下血管活性因子对血管内皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响

作者研究了在缺氧条件下脐静脉血管内皮细胞血管内皮生长因子 (VEGF)表达及缩血管活性物质内皮素、舒血管活性物质NO和NO抑制剂LNNA对VEGF基因表达的影响。体外培养人脐静脉血管内皮细胞经缺氧及血管活性物质处理、Northern杂交、酶联免疫检测和计算机图像分析等观察VEGFmRNA和蛋白表达水平。结果显示 :缺氧 6h内皮细胞可见VEGF表达 ,ET可促进VEGFmRNA的表达 ,NO可明显抑制VEGFmRNA的表达 ,NO抑制剂LNNA也影响VEGFmRNA的表达。ELISA检测VEGF蛋白水平分别为 6h组 ( 8.2± 1 .1 ) μg/L ,ET +6h组 ( 9.3 7± 1 .…     

Angiostatin基因转染对膀胱癌BIU-87细胞系生物学行为的影响

目的 探讨外源性血管抑素(angiostatin)基因在人膀胱癌BIU-87细胞中的表达及其意义。方法 将人全长angiostatin基因经脂质体包裹转染膀胱癌BIU-87细胞，行G418筛选获得转基因瘤细胞克隆，比较转基因和未转基因的瘤细胞生长特性。采用免疫荧光、免疫组化及Western blot等方法检测瘤细胞angiostatin蛋白的表达，并应用鸡胚尿囊膜血管生成实验及脐静脉内皮细胞增殖实验检测其活性。结果 外源性angiostatin基因的表达对BIU-87瘤细胞的生长并无影响。转染细胞在体外明显抑制脐静脉内皮细胞的增殖并对鸡胚尿囊膜的血管生成具有明显的抑制作用。结论Angiostatin能特异性地抑制血管内皮细胞增殖，进而抑制血管生成。     

肝细胞生长因子对心肌细胞及血管平滑肌细胞、血管内皮细胞生长因子分泌的作用

观察肝细胞生长因子(HGF)对体外培养的牛冠状动脉血管内皮细胞 (BCAEC)、牛冠状动脉血管平滑肌细胞 (BCASMC)和小鼠心肌细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)分泌的影响。BCAEC对照组与HGF组 12hVEGF浓度分别为 10 5 1± 2 90和 9 31± 2 78pg/ml;BCASMC对照组和HGF组 12hVEGF浓度分别为 3h的 3 35倍和 3 93倍 ,HGF组 3h和 12hVEGF浓度分别为对照组的 2 0 6倍和 2 4 2倍 ;心肌细胞对照组和HGF组 12hVEGF浓度分别为 3h的 5 4 3倍和 4 0 9倍 ,HGF组 3h和 12hVEGF浓度分别为对照组的 2 74倍和 2 0 6倍。提示BCAEC、BCASMC及小鼠心肌细胞均具有自分泌VEGF的作用 ,HGF促进BCASMC和心肌细胞VEGF的分泌 ,对BCAEC无影响     

EGFP标记的VEGF165重组质粒的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建pIRES2-EGFP-VEGF165真核表达质粒,并在大鼠骨髓间充质干细胞内表达。方法应用DNA重组方法构建pIRES2-EGFP-VEGF165,并将其转染到大鼠骨髓间充质干细胞内,采用ELISA和MTT法检测转染后细胞培养上清液中VHGF165的含量及生物活性。结果成功构建了pIRES2-EGFP-VHGF165,将其转染骨髓间充质干细胞后,VEGF蛋白表达水平明显增高．转染后的细胞培养上清具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论成功构建了真核表达质粒pIRES2-EGFP-VEGFl65．将其转染骨髓间充质干细胞后可高水平地表达具有生物学活性的VEGF蛋白。     

增生性瘢痕中成纤维细胞生物学功能变化与微血管病理改变的研究

目的 探索增生性瘢痕中成纤维细胞的生物学功能变化与微血管病理改变的关系.方法 首先取人增生性瘢痕组织和正常皮肤组织进行HE染色观察,分离和培养瘢痕和正常皮肤中成纤维细胞,ELISA分别测定2种来源的成纤维细胞在转移生长因子(TGF-β1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、内皮素-1(ET-1)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)分泌水平的变化,再采用Transwell 共培养模式,观察增生性瘢痕中成纤维细胞对血管内皮细胞增殖的影响.结果 HE染色可见正常皮肤微血管数目较少,胶原疏松.增生期瘢痕胶原致密,微血管数目增多,微血管狭长扭曲,甚至闭塞.ELISA检测结果发现,增生性瘢痕中成纤维细胞TGF-β1、bFGF、PDGF、ET-1和VEGF分泌水平明显高于正常皮肤来源的成纤维细胞.另外,Transwell 共培养结果发现,增生性瘢痕来源的成纤维细胞具有显著促进血管内皮细胞增殖的作用.结论 增生性瘢痕中微血管的病理改变与成纤维细胞大量产生TGF-β1、FGF、PDGF、ET-1和VEGF等因子有关.     

重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定

目的人血管内皮生长因子（的hVEGF165）为靶基因,增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因构建体的复制缺陷型腺病毒载体,为基因治疗牙周进一步再生奠定了基础。方法质粒的pDC316-的VEGF165为模板,PCR扩增基因片段进行消化,获得的hVEGF165用于连接到含有绿色荧光蛋白标记基因重组质粒的消化方法的pDC316-MCMV-EGFP质粒载体,PCR鉴定和双酶切证实成功构建重组质粒;使用ADMAX包装系统,改造的质粒共转染用质粒骨架293包装细胞系和重组病毒的扩增;扩增病毒的离子交换纯化;TCID50测定病毒粒子和效价的数目;的荧光的荧光显微镜重组腺病毒表达。结果 PCR鉴定,酶切分析和测序证实成功构建人VEGF基因的携带绿色荧光蛋白标记（的hVEGF165）重组质粒的pDC316-的hVEGF165-MCMV-EGFP和同源重组腺病毒Ad5的-的hVEGF165-EGFP的成功。扩增和纯化后,腺病毒颗粒的数量测量5.4×1011VP/mL,约2.0,为1.8×1010CCID50/mL的滴度OD260/OD280值。结论成功构建携带hVEGF165基因重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP并获得高滴度病毒颗粒,为hVEGF165基因功能研究以及细胞移植、基因治疗提供有效的工具。     

血管内皮细胞生长因子基因治疗对骨髓微血管照射损伤的修复

目的　探讨内皮生长因子对骨髓移植小鼠骨髓微血管损伤修复的影响。方法　利用腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子1 6 5(hVEGF1 6 5)在骨髓移植小鼠体内表达 ,检测骨髓微血管系统和造血细胞容量变化。结果　 10d接受hVEGF1 6 5基因治疗的小鼠胫骨中央静脉肿胀程度明显轻于注射腺病毒AdEGFP组和常规移植组 (P <0 0 1) ; 2 0d时该组小鼠胫骨中央静脉直径、微血管灌注面积已恢复正常 (P >0 0 5 ) ,且骨髓细胞容量高于其他组 (P <0 0 5 )。结论　VEGF基因体内高效表达可以加快全身照射引起的骨髓移植小鼠骨髓微血管损伤的修复 ,重塑微血管结构 ,促进骨髓造血功能的重建。     

缺氧条件下血管活性因子对血管内皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响

文章探讨在缺氧条件下人脐静脉血管内皮细胞血管内皮生长因子 (ＶＥＧＦ)表达及缩血管活性物质内皮素、舒血管活性物质ＮＯ和ＮＯ抑制剂ＬＮＮＡ对ＶＥＧＦ基因表达的影响。采用体外培养人脐静脉血管内皮细胞、缺氧及血管活性物质处理、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、酶联免疫检测和计算机图像分析等方法观察ＶＥＧＦｍＲＮＡ和蛋白表达水平。结果发现 ,ＶＥＧＦ基因在正常情况下及缺氧 3ｈ检测不出 ,而缺氧 6ｈ可见有ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达。ＥＴ、ＮＯ、ＬＮＮＡ对血管内皮细胞处理后 ,检测到ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达 ,ＥＴ能促进ＶＥＧＦｍＲＮＡ的…     

MAPK信号转导途径参与bFGF抑制辐射诱导的脐静脉内皮细胞凋亡的作用

目的　研究碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对辐射诱导的血管内皮细胞凋亡的作用及其信号转导途径。方法　以6 0 Coγ射线照射建立原代分离培养的人脐带静脉内皮细胞凋亡模型 ,以流式细胞术 (Annexin V FITC +PI标记 )评价细胞凋亡率。观察不同浓度的bFGF和MEK的抑制剂U0 12 6对细胞凋亡的影响。结果　bFGF对辐射诱导的脐静脉内皮细胞凋亡有明显的抑制作用 ,细胞凋亡率可从 (35 2 2± 5 5 ) %降至 (11 6 7± 3 8) % ,而U0 12 6可部分阻断bFGF的抗凋亡作用 ,细胞凋亡率由 (10 5 9± 1 6 ) %升至 (17 96± 1 4 ) %。结论　bFGF可能通过MAPK信号转导途径抑制辐射诱导的脐静脉内皮细胞凋亡。     

血管内皮生长因子转基因治疗小鼠辐射损伤的实验研究

目的 通过构建血管内皮生长因子(VEGF)基因的真核表达质粒,并将其转入受照小鼠机体,研究VEGF蛋白表达对放射损伤的救治作用及其分子机制。方法 昆明种小鼠通过随机化分组表法随机分为正常对照组、单纯照射组和转基因组。转基因组应用VEGF重组质粒进行肌肉注射,注射后24 h接受8 Gy X射线照射,进行小鼠临床表现和死亡率观察。并于照后不同时间处死动物,进行组织器官病理学和原位胸腺和脾细胞凋亡检测。结果 用PCR方法从pSP73/H_VEGF165质粒扩增得到VEGF₁₆₅基因片段,经双酶切后与酶切的pcDNA3.1载体连接,构建重组质粒pcDNA3.1/ VEGF₁₆₅,经电泳和测序表明序列与GeneBank完全一致。X射线8 Gy照射小鼠,单纯照射组14 d内死亡率为64%,而转基因组为36%,两组比较差异有统计学意义(t=3.92,P＜0.05)。转基因组小鼠胸腺和脾组织的细胞凋亡率显著降低(t=3.11、3.53,P＜0.05),放射病理损伤明显改善。结论 成功构建了重组质粒pcDNA3.1/ VEGF₁₆₅,重组质粒转基因治疗可显著降低严重辐射损伤小鼠的死亡率,显著减低胸腺和脾脏细胞凋亡率,明显改善免疫器官的病理变化。     

移植成血管基因修饰MSCs改善心肌梗死大鼠左室血流动力学参数的研究

目的探讨大鼠心肌梗死模型缺血心肌局部移植血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）修饰的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）对左室血流动力学参数的影响。方法 Percoll液密度梯度离心法分离、贴壁培养Wistar近交系大鼠MSCs,真核表达载体pcDNA3.1（-）/hVEGF165转染MSCs。30只Wistar近交系大鼠随机均分为转染组（MSCs/VEGF组）、对照组（MSCs组）、无血清培养基组（DMEM组）。结扎前降支建立急性心肌梗死模型后在梗死区边缘区行5×106（40μl）细胞移植,DMEM组行等量培养基注射。移植前细胞行CM-DiI标记。移植1个月后行心脏B超测量EF值,经右侧颈内动脉左室内置管测量如下血流动力学参数：心率（heart rate,HR）、左室收缩末压（left ventricularend-systolic pressure,LVESP）、左室舒张末压（left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP）、最大左室内压上升速率（＋dp/dtmax）、最大左室内压下降速率（-dp/dtmax）。大体标本组织行HE、Masson染色。结果培养的MSCs呈典型贴壁生长成纤维细胞样外观,CM-DiI能近100%标记MSCs。移植后1个月MSCs/VEGF组较其余两组LVEF、LVESP、LVEDP、＋dp/dtmax、-dp/dtmax值有显著性差异（P〈0.05）,大体标本HE、Masson染色染色病理变化亦明显优于其余两组。结论大鼠心肌梗死模型梗死心肌局部移植VEGF基因转染MSCs能显著改善左室血流动力学参数,进而改善心脏功能。     

创伤后单核巨噬细胞集落刺激因子调控新生血管化的分子机制

目的 观察创伤愈合过程中单核巨噬细胞集落刺激因子(granuiocyte/macrophage colony - stimulating factor,GMCSF)经ERK通路活化核因子(nuclear factor,NF) - Κb诱导创伤后人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs）生成血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),并探讨相关机制。方法 分离培养创伤部位HDFs,并用GMCSF处理。作用不同时间后,采用RT - PCR和ELISA分别检测HDFs VEGF Mrna和蛋白水平;应用GMCSF作用HDFs后,采用Western blot观察ERK磷酸化水平的改变;进一步应用ERK通路特异性抑制剂PD98059预处理HDFs。再用GMCSF刺激已预处理过的细胞,收集细胞和上清液,采用Western blot检测VEGF蛋白水平的变化;进一步通过抑制ERK信号通路,采用免疫荧光检测NF - Κb的活化。另外,应用核质抽提试剂盒分离胞质和胞核,采用Western blot检测NF - Κb的活化。结果 随着GMCSF浓度的增加,VEGF Mrna及蛋白水平也逐步增加,呈一定的剂量依赖性;GMCSF作用于HDFs 2 h后,VEGF Mrna水平开始升高,至4～6h达到峰值。GMCSF能够显著活化ERK磷酸化过程;与GMCSF组相比,ERK信号通路特异性抑制剂PD98059能显著抑制GMCSF诱导VEGF的表达(P＜0.05)。免疫荧光和Western blot结果显示,抑制ERK后NF - Κb的活化受到显著抑制。结论 GMCSF可通过ERK信号通路活化NF - Κb从而诱导HDFsVEGF的表达。     

Vascular endothelial growth factor in the early stage of skin incision wounds in cyclophosphamide-induced leukocytopenic rats

Wound healing evaluation is important in forensic pathology. We have already shown that vascular endothelial growth factor (VEGF) is produced in the rat skin incision wounds. In this study, we used cyclophosphamide hydrate (CPM) to induce leukocytopenia in rats, and measured VEGF in the skin incision wound area to assess the involvement of leukocytes in the early production of VEGF. Male Sprague–Dawley (SD) rats were intraperitoneally administered CPM 75 mg/kg body weight on day 0 and 5, and dorsal skin incision wounds were made on day 5. One and 3 days after the skin incision, leukocytes counts were determined and skin specimens from the wounds were collected for measurements of total proteins, VEGF proteins, and semi-quantification of VEGF mRNA. VEGF immunohistochemistry and in situ hybridization for VEGF mRNA were also performed. VEGF proteins were smaller in the amount statistically significantly in the 1- and 3-day-old wounds of CPM-induced leukocytopenic rats, whereas VEGF mRNA was increased compared with saline-treated control rats. Immunohistochemically, VEGF was positive in leukocytes and mesenchymal cells including fibroblasts and endothelial cells in the 3-day-old wound of saline-administered control rats, while a few fibroblasts and endothelial cells were positively stained in CPM-administered rats. In situ hybridization showed the localization of VEGF mRNA in mesenchymal cells including fibroblasts and endothelial cells in the 1-day-old wound of CPM-administered rats, whereas saline-administered control rats also showed VEGF mRNA positivity in leukocytes. Our study indicates that leukocytes may be the major source of VEGF in the early stage of the rat skin incision wound.     

A human transferrin-vascular endothelial growth factor (hnTf-VEGF) fusion protein containing an integrated binding site for (111)In for imaging tumor angiogenesis.

Our objective was to synthesize a recombinant protein (hnTf-VEGF [VEGF is vascular endothelial growth factor]) composed of VEGF(165) fused through a flexible polypeptide linker (GGGGS)(3) to the n-lobe of human transferrin (hnTf) for imaging angiogenesis. The hnTf domain allowed labeling with (111)In at a site remote from the VEGF receptor-binding domain. METHODS: DNA encoding hnTf, peptide linker (GGGGS)(3), and VEGF(165) genes were cloned into the Pichia pastoris vector pPICZalphaB to generate the pPICZalphaB-hnTF-VEGF plasmid. The expression vector was transformed into P. pastoris KM71H strain. The protein was purified using Co(2+) metal affinity resin. The growth-stimulatory effects of hnTf-VEGF on human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs) and its binding to porcine aortic endothelial cells (PAECs) transfected with VEGF receptors were evaluated. hnTf-VEGF protein was labeled with (111)InCl(3) in 10 mmol/L HEPES/15 mmol/L NaHCO(3) buffer, pH 7.4 (HEPES is N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid). The loss of (111)In in vitro from (111)In-hnTf-VEGF to transferrin in human plasma and to diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) in buffer was determined. Tumor and normal tissue distributions of (111)In-hnTf-VEGF were evaluated in athymic mice implanted subcutaneously with U87MG human glioblastoma xenografts. Tumor imaging was performed. RESULTS: Sodium dodecylsulfate-polyacrylamine gel electrophoresis under reducing and nonreducing conditions showed bands for hnTf-VEGF monomer (M(r) of 65 kDa) and dimer (M(r) of 130 kDa). hnTf-VEGF stimulated the growth of HUVECs 3-fold and demonstrated binding to PAECs displaced by a 50-fold excess of VEGF(165) but not by apotransferrin. There was 21.3% +/- 3.4% loss of (111)In per day from (111)In-hnTf-VEGF to transferrin in plasma, but <5% loss to DTPA over 4 h. (111)In-hnTf-VEGF accumulated in U87MG tumors (6.7% injected dose per gram at 72 h after injection) and its tumor uptake decreased 15-fold by coadministration of a 100-fold excess of VEGF but not by apotransferrin. The tumor-to-blood ratio was 4.9:1 at 72 h after injection and tumors were imaged at 24-72 h after injection. CONCLUSION: (111)In-hnTf-VEGF is a promising radiopharmaceutical for imaging tumor angiogenesis and represents a prototypic protein harboring the metal-binding site of transferrin for labeling with (111)In without introducing DTPA metal chelators.     

二维和三维培养的人皮肤成纤维细胞中生长因子mRNA表达的比较研究

探讨经二维或三维培养的人皮肤成纤维细胞在细胞因子表达能力方面是否有差异。以平面培养皿作为成纤维细胞二维培养系统 ,用胶原凝胶作为成纤维细胞三维培养系统 ,分别提取二维和三维培养的人皮肤成纤维细胞总RNA ,采用RT PCR方法检测两种培养系统中血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)mRNA的表达。结果显示 ,虽然二维和三维培养的人皮肤成纤维细胞形态不同 ,但二维和三维培养的成纤维细胞均有VEGF/bFGF设计大小的条带显示 ,且两者条带相对灰度无明显差异。提示三维培养对人皮肤成纤维细胞的生长因子mRNA表达无明显影响     

重组人血管能抑制素分泌型表达载体的构建及其生物学效应研究

目的　构建表达分泌型人血管能抑制素 (canstatin)蛋白的真核表达载体 ,观察其生物学效应。方法　以SOEPCR法将canstatin及癌胚抗原 (CEA)引导肽cDNA体外连接 ,并定向克隆到真核蛋白表达载体pCMV Script上 ,脂质体介导转染HUVEC及A5 4 9细胞 ,荧光定量PCR法检测转染细胞canstatin基因表达量 ,并采用多种方法检测该重组载体的生物学活性。结果　成功构建canstatin分泌型载体 ,在其转染的肿瘤细胞和人脐静脉内皮细胞中均检测到不同拷贝数的表达。转染后HUVEC生长增殖缓慢 ,出现G0 ～G1期阻滞并伴有大量凋亡 ,与空载体转染组相比差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ;而A5 4 9细胞转染后与空载体转染组在以上几个方面差异均无统计学意义 (P >0 0 5 )。重组载体转染A5 4 9细胞上清液干预的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成明显减少 ,且颜色苍白、轮廓模糊 ,空载体转染组和未干预组血管生长旺盛、脉络清晰。结论　SOE法构建的含有CEA引导肽的canstatin分泌型表达载体能在转染的内皮细胞及肺癌细胞中稳定表达 ,可有效抑制内皮细胞生长增殖并诱导凋亡。重组载体转染的细胞可分泌有生物学活性的canstatin。     

AngiostatinK(1-3)裸DNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

探讨ＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）〖ＡＫ（１－３）〗裸ＤＮＡ治疗人脑胶质可行性和作用机制。用脂质体包埋法将ＡＫ（１－３）基因的真表达载体ｐｃＤＮＡ－ＳＡＫ（１－３）注入裸以下ＳＨＧ４４人脑胶质瘤的特点。ＡＫ（１－３）裸ＤＮＡ在荷瘤裸本内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤血管生成能力显著下降,肿瘤生长受到抑制,抑瘤率达４３％。本研究证明,ＡＫ（１－３）裸ＤＮＡ能抑制人脑质瘤生长,为非病毒载体介导的抗血管生